A******r
发帖数: 121 | 1 首先谢谢大家的时间。因为自己是工程专业，没有生物背景，所以特来问问诸位经验丰
富的大侠们对此的看法。
实验大致上是用喷雾剂喷出一些virus stock suspension，接着用gelatin filter收集
这些带有病毒的小颗粒，然后把gelatin filter溶解在beef extract溶液中，最后用
infectivity assay测病毒的感染性，以及用qPCR测总共病毒的量。
照理qPCR测的是病毒DNA/RNA，而在雾化和空气传播过程中病毒又会失掉一些
infectivity，所以qPCR结果应该要比infectivity assay得到的值（TCID50或PFU）要
高，但是尝试了几种动物病毒和噬菌体之后，qPCR给出的结果都要比infectivity
assay要低（有的甚至低大于一个数量级）。
qPCR的standard curve就是用已知浓度的virus stock系列稀释之后做的。考虑过
gelatin filter和beef extract对viral nucleic acid extraction的影响，也做了几
个小实验验证了一下，发现是有一些影... 阅读全帖 |
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g*********3
发帖数: 177 | 2 谢谢toll的回答。不好意思，我有一个typo，已经改正过来了。Ct difference in
sample is 6.
嗯，Input确实可以用1%来做，不过在QPCR之前，我测了浓度，也做了QPCR dilution
test，所以这个应该不是问题。
你提的建议很好，我其实也做了negative primer qpcr,做出来的Ct是NA，说明CHIP结
果的特异性还是不错的。
我说的control就是你提到的KO cell line.
"最后用chip/input%的方式来表达，不要任何的normalization"
这其实也是我最感兴趣的信息，我查了几篇paper，发现别人用HA tag做的CHIP，yield
也很低，大概只能pull down 2%左右的DNA （方法也是通过比较Input和Sample这个某
个特定region的QPCR ct）。
我知道IP nuclear protein效率大概是10-20%或者更低点，但没想到DNA的效率这么低
。还是我实验出了问题，
请问有什么步骤是需要优化的吗？
谢谢toll和各位。 |
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f******9
发帖数: 39 | 3 刚刚开始接触qPCR，要比较某类基因在细胞做了不同处理后的表达是否有显著性变化。
请教各位qPCR大侠，怎么样界定qPCR中基因表达的变化（normlization之后）是否显著
？statistic analysis? 还是至少2－3fold的变化才有意义？ |
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m**********d
发帖数: 137 | 4 新设计了primer，扩增genomic DNA的某片段，170bp左右，用qPCR来定量，primer退火
温度已测好，57°C
用SYBR green做qPCR，SYBR新从BioRad订的
25μl total volume
12.5μl SYBR green master mix + 0.1μl primerF (0.1μM in the fianl
concentration)+ 0.1μl primerR + 50ng genomic DNA + H2O fill up to 25μl
用的PCR program如下：
95°C 10min + (95°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) 40cycle + dissociation
curve
72°C elongation step读数
结果没有任何信号，dissociation curve当然也没信号或者有一些非常弱且杂乱的信号
我把sample拿出来，跑了个2%agar gel，结果非常清晰干净的一条带，size完全正确，
看不到primer dimer或者其他non-specific ... 阅读全帖 |
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a****o
发帖数: 2 | 5 忘了补充两点
the PCR products for making qPCR standard also had smeary bands. I had tried
my best to minimized it by nested PCR with low concentration of DNA
template. But I assume certain unspecific amplifications still remained in
the qPCR standard, which could lead to smeary bands for the samples of qPCR
standard. It however does not explain the existence of smeary bands for the
tested samples.
Another thing it the Ct value is smaller than usual. |
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s*****g
发帖数: 87 | 6 For qPCR, primers need to be specially designed to avoid the formation of
primer dimer and smear.
you can try the primer designing tool from IDT and redesign your qPCR
primers, which are the most important thing for a successful qPCR.
http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/ |
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L****e
发帖数: 499 | 7 自己能设计，但是就是不太自信自己设计的。最近特地比较了一下从两篇不同的文章上
copy 的用于同一个基因的QPCR引物，这一做吓一跳，结果完全不一样，其中一对还是
一中国大陆的 cell metabolism文章上的引物，太坑爹了。刚才顺便看了一下bioRad
上的QPCR引物，价格简直吓死人啊 200 reactions 要$120,1000 reactions HPLC 要$
1000,这谁买得起啊。
请问一下大家做QPCR引物都是自己设计还是参考别人的文章，还是直接从公司买啊？ |
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L**o
发帖数: 15 | 8 做了一个常规的chip-qPCR想检测一个转录因子有没有在某个基因的启动子区有富集，
先用特异性的抗体做CHIP，然后做qPCR，结果和mock相比，在启动子区和几个CNS区都
没有明显富集。当时错拿了一管该基因的普通qPCR引物，在该基因外显子上，结果在这
个区域像是有富集，相比mock，转化成input%大概是3%比0.1%
这怎么解释呢？
多谢指教。 |
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m*****n
发帖数: 760 | 9 最近在做一些miRNA qPCR，mouse brain sample，
用的是Exiqon的universal miRNA PCR，
reference ctrl试过5s rRNA和U6，可是这2个ctrl好像不是很consistent，
所以不知道如何去normalize data。
请问版上大牛，你们在做miRNA qPCR时，用什么reference ctrl？ |
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a***y
发帖数: 19743 | 10 谢谢。给你发包子了。
补充说明一下
这个是三个biological replicate
然后跑qPCR的时候有每个biological replicate有三个tech rep
qPCR tech rep之间差异很小，所以不是loading的问题
biological rep之间Ct差异很大。作为control，我觉得有这么大的差异，使得数据分
析和结果分析几乎不可能……除非接受平均值是可信的。
还有谁能给点意见？
谢谢！ |
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k****o
发帖数: 589 | 11 以前提RNA做qPCR几乎从未失手过。最近用了一个抑制剂处理细胞，结果qPCR时目标基
因扩增很正常，用来参照的18S rRNA却扩增得很奇怪。具体说来是18S的PCR log phase
来得提前，有些样品的RFU干脆没有log phase，从一开始就一直线性增加。重新配制了
primer，问题没有解决。用以前的老样品跑18S，一切正常。这种情况可能是什么因素
引起的？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 我的直觉就是你们可能没有在qPCR的时候做loading control
qPCR 的时候会因为样品制备和实验室试剂的差异而出现比较大的偏差，
所以一般需要一个内部control 来调整最后的值。对于你们这个实验，
是否可以考虑用host cell actin and GAPDH 来做loading control? |
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a****o
发帖数: 2 | 13 各位大侠帮帮忙。
我们小组是做土壤微生物的。最近我们组的qPCR 和PCR 的质量都不理想，两个assays
跑出来的gel都很模糊。Both assays give smeary bands in agarose gel, and it
sometimes happens to have double bands for qPCR.
This problem used to occurred quite a long time ago. And some of the assays
are quite routine in the lab. Our group discuss this problem before, and
cannot solve it. Anyone can give recommendations? Many thanks.
Very urgent. |
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m****M
发帖数: 360 | 14 如果你确定你稀释是正确的，而且引物没有任何问题，我建议你换新的２X qPCR
Master Mix，或换另外一个公司的。同时，看看最近用同一台机器的其他人的扩增如何
，最近qPCR machine是否Calibrate过。 |
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l*********e
发帖数: 118 | 15 请问qPCR结果,如果IgG control也有enrichment,是不是表示这些都是background
noise? 我测了四对primer,fold enrichment relative to input大概在3-10倍.
qpcr产物跑了胶,size都是正确的.
另外请问,如果不确定我的抗体的binding region,怎么才能证明抗体能work in ChIP?
我想用这个抗体做ChIP-Seq |
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H**1
发帖数: 34 | 16 小弟设计了一些primer，用来做RT-QPCR，检测几个基因的mRNA在WT和KD细胞的变化。
设计好了primer，小弟先在WT和KO细胞测试引物的efficiency。
小弟把cDNA稀释成1：5，1：10，1：20，1：40，然后做QPCR，计算efficiency。
结果发现同一个引物，在两个细胞系的efficiency居然不同。
请教这是为什么？
着急。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 17 firstly,
time point of your mRNA knockdown
=/=
time point of your protein clearance
1.5,
i saw good KD on WB with ~70% on qPCR before, probably due to different
sensitivity of WB and QPCR
2.
is normalizing control gene the same in different methods? |
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i*********0
发帖数: 915 | 18 谢谢大家的评论。我准备先做一个house keeping gene 的qPCR，然后做dilution，把
它们的ct值调到相当，再做我要的target gene 的qPCR吧。 |
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n****3
发帖数: 543 | 19 qPCR做的比较少，没有经验，求高人指点。
我现在有实验组和对照两个样品，反转录起始的rna量不相同，qpcr出来的结果内参和
靶基因的ct， 可以比较吗？如何比较 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 20 有很多东西发表的多数论文并不严格遵守。
比如QPCR的error Bar通常就是复孔算出来的，不是严格意义上的生物学重复。细胞生
长曲线等也类似。
要说standard deviation，同组不同个体小鼠的肿瘤生长曲线才是严格意义上SD。
QPCR三个复孔，可以去掉一个明显偏离另两个孔的值吗？
这些混乱如何解决？ |
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h*****G
发帖数: 113 | 21
—— 不能这么说，尤其本文提到的qPCR重复，应该是非常清楚的，并不存在混乱的说
法。
－－qPCR的复孔是technical repeats， 肯定是不能用来计算error bar的，从任何意
义上来说都不是生物学重复。
三个复孔，如果偶尔出现一个明显偏离另两个孔的值，可以去掉。但是如果实验中总是
重现这种情况，那说明加样的时候有问题，这样的实验结果就不可靠。 |
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F******p
发帖数: 2099 | 22 >32 is not reliable.
I suspect you were using 2 primers qPCR. Try 2 primers and probe based qPCR
, that is way more reliable.
cycles |
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k*******s
发帖数: 214 | 23 FACx分离的细胞，用chemical处理后想看看基因表达的差异。请推荐一个qPCR仪器。不
知道有没有人用过Beckman AmpliGrid AG480F. thx. |
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b***g
发帖数: 516 | 24 你的qPCR的引物在不同的exon么
我是说会不会是genomic contamination |
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A***g
发帖数: 191 | 25 做了二十多个基因在十几个不同的人的细胞系中的表达量实验。
用的是qPCR方法。我的做法是，以cDNA为模板，以GAPDH为internal control，做看家
基因的模板多稀释20倍。
结果分析呢，我用的是 2-△△CT Method，设定某个基因在某个细胞系中的表达量为1
（这个细胞系也就是我设定的对照），那该基因在不同细胞系中的表达量就都是相对这
个细胞系而言，这样得出来的结果是relative expression level.
可是老板要的结果是最好能一目了然能看清不同基因在同一细胞系中的表达量变化，同
时也能兼顾在其它细胞系中的表达量变化。她说我给她的结果很容易让人误解。因为每
个基因都有一个细胞系为1，看上去好像这两个基因表达量一样似的。
我用的这个公式应该不能够比较不同基因的表达量吧？
同时我为了结果好看，基本上都是选择表达量比较低的细胞系为1，这样有的表达量高
的数值就很大，我老板就以为这个数字这么打是不是表达量很高很高啊？
我家老板要达到的这个目的要怎么分析呢？有没有相关文献啊？ |
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E*******2
发帖数: 131 | 26 我正在做ChIP-qPCR， anti acetyl Histone H3 and H4, 将来也会考虑做anti
methylation histones，现在遇到的问题
是，找不到合适的control gene primers. Millipore 公司提供的chip kits里用的
GAPDH。 但是我们领域有几篇文章是用
的beta globin和beta tubulin。我的老板说用我们领域已发表的。然后我查了一下他
们用的primer sequences，有意思的
是他们用的是小鼠，但是primer sequences和大鼠的基因是完全匹配的，而和小鼠有1
－2个碱基不匹配。并且beta
globin的primer在大鼠基因中扩增的是hemoglobin epsilone2，而在小鼠中最可能扩增
的是hemoglobin y， beta－like
embryonic chain。 我的问题是，如果我选择beta globin做为我的control gene，我
是否应该重新设计primer，还是说
我可以直接用人家发表的primer sequence？但是他们用的是sybr |
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w****l
发帖数: 5 | 27 我正在寻找一对beta Actin qPCR引物， 其要求是既能用于人也能用于小鼠的genomic
DNA 或者cDNA。网络或者文献中确实有很多现成的引物，但都是种属特异性的。各位认
为是否有可能找到我所要的引物吗？ |
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L**********r
发帖数: 143 | 28 Can someone comment on qPCR systems from ABI, BioRad, Stratagene, Eppendorf,
Roche, and Cepheid;
regarding cost, analysis software, reliability, customer support, etc. |
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c*********r
发帖数: 1312 | 29 同问，最近Illumina也推出了一款qPCR仪，不知道如何？ |
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f*****y
发帖数: 464 | 30 本人统计学得粗浅，关于qPCR分析想请教大牛们：
1.如果5组treatment数据，每组4个samples. 是选择直接做non-parametric如kruskal-
Wallis test好，还是先确定是normal distribution然后做one-way ANOVA更容易被
reviewer接受？ANOVA的p-value似乎总是更好看一些。
2.给这些数据做post-hoc test,到底有什么讲究？Duncan, LSD, Tukey等这些是不是哪
个好看就选哪个？另外non-parametric test的post-hoc用SAS怎么做呢？
2.本人想做一个gene expression time-course, 5个时间点，每个时间点只有4个
sample。我计划就是先做个ANOVA,然后做个LSD做post-hoc,根据post-hoc来说明表达高
峰在那个时间。这样合理吗？
提前谢谢指点。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 31 我的QPCR结果导出为EXCEL文件。
自动把EXCEL的结果复制进去，就能算出来相对于control的百分制值。
谁有啊？或者用EXCEL自己做的函数？
谢谢了。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 32 说点有点关系的。上周五参加一个talk, affimetrix的人过来，
说他们可以看fix的细胞里面单个RNA，可以count，这个应该比qPCR强。
当然，现在还有dPCR啥的 |
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m**********d
发帖数: 137 | 33 double check了，位置没load错
实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
detector坏掉了
还有别的啥可能么 |
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m**********d
发帖数: 137 | 34 问了一圈人，可能是pPCR machine跟reagent不compatible
实验室的qPCR仪是ABI 7300，订的是bio-rad的SYBR,据说要想用这个机器需要另加ROX
，或者换到ABI7900机器，或者从ABI订SYBR green(has ROX in it)
dissociation |
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k****1
发帖数: 123 | 35 最近在学ChIP-qPCR,实验室没人做这个没人教，查了好久还是觉得稀里糊涂的@#……！
%@￥*&……
网上查到看enrichment常用方法是percentage input,calculated by 100 x 2^(Ct_
adjusted Input — Ct_Enriched)。但是我不明白到底是什么原理，这样求出来的结果
难道是绝对量么？是真正的IP中的copy number占input的百分比么？我觉得要得出这个
结果至少还需要假设input的总体积和IP的总体积是相同的，否则，如果在最后溶解IP
的时候用的水的体积不一样，浓度就会不一样，得出的relative的enrichment也会不一
样啊。。。。。
越想越混乱，急，
谢谢大家帮忙~~~~~~~~~~~~~ |
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c****r
发帖数: 199 | 36 用SYBR Green做了qPCR, 看dissociation curve的时候发现，虽然只有一个
peak, 但是当template的浓度变低时，这个peak所在的位置也跟着shift到低一
些的温度。大虾们给说说这是怎么回事情？
谢谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 37 问个笼统的问题
在cRNA microarray raw data差别极高的情况下， 如chontrol 10000 treated 30000
这样的数据真实度有多少？在qPCR中能指望看到多少差异？在luciferase promoter
assay中呢？
另外，如果差异是在transient express某个目的基因后得到的，大家通常如何把
transfect efficiency normalize到fold change中呢？直接做乘法？ |
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m*******u
发帖数: 173 | 38 请大家推荐些qPCR data analysis 的软件 多谢了 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 39 请问大家：我现在不得不需要手工处理qPCR数据。已知实验组（1）的Ct与Stddev，和
内对照（0）的Ct与Stddev，计算实验组的相对数量，用公式exp(-Ct1)/exp(-Ct0)（不
知道对不对？），可是这个算出来的值，它的标准差又怎么计算呢？多谢多谢！大家周
末愉快！ |
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c**********e
发帖数: 230 | 40 功课没做够，打回去。
biorad网上，qPCR相关的介绍里就推荐的 |
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s**********r
发帖数: 1120 | 41 我用SYBR做QPCR检测细胞中shRNA的表达．因为对照细胞的CT没有数值（ＮＴ），所以
只能算deltaCT,(用U6miRNA做control)．我的shRNA的CT分别是29.43,31.56, U6 CT分
别是29.84,29.74，deltaCT就分别是-0.41, 1.82，对吧？那做图的时候直接用这个数
值就行了，还是要计算2(-deltaCT)？有明白的同学给解释一下吧，非常感谢． |
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n****n
发帖数: 610 | 42 以前microarray时代是一定要做qPCR来确认up/down regulation.不知道在RNAseq的时
代还有没有必要做？ 哪位高人有经验？ 我在literature里面没看到这方面的信息。 |
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d****d
发帖数: 214 | 43 我最近在做通过标准曲线来做相对定量的qPCR分析。我推测在做标准样品的系列稀释时
，由于总有一些DNA会非专一地吸附在试管壁上，因此当模板低到一定程度时，这种非
专一的吸附就会干扰标准曲线的准确度。我发现如果用纯水做系列稀释时，高稀释度的
样品的CT值确实比低稀释度的样品的CT值不成比例地高。如果用含低浓度的Salmon
Sperm DNA的水来做系列稀释，则情况会有所改善。不知各位有经验的同行是如何解决
这个问题的。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 LZ为了过份表达 选的promoter inserted xxxxx bases upstream of the Start codon may affect the Kozak
sequence or rbs.
then a nonsense mutation is a mutation that causes a premature stop,
resulting in a truncated or nonfunctional protein
NB: if it is my misunderstood please let me know it.
回复]
>发信人: vonda (Vonda), 信区: Biology
标 题: Re: 用qPCR检测mRNA，高1000倍，却看不到蛋白
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 31 19:01:56 2012, 美东)
天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway... 阅读全帖 |
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b*******0
发帖数: 125 | 45 弱弱的问个白痴问题，qPCR 加 Master Mix（除cDNA）时 有没有必要换枪头呢？
我们做的是384孔板。买的是排枪，枪头价格不菲。加cDNA 肯定是换枪头的。但是加 Master Mix有没有必要换呢？有经验的讲讲 |
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a*****s
发帖数: 131 | 46 Hello everyone, please help: how to detect low abundance gene expression?
Now I use 1 ug of RNA per 20 ul cDNA reaction, then I use 1 ul of the cDNA.
For beta-Actin, the qPCR picks up the signal at around 15 cycles in linear
range. But my target gene (I used 2.5 ul per reaction) can only be picked up
at around 35 cycles (1 or 2 out of triplicated reactions), where it is
already out of the linear range!! How to enhance the signal?? Please help!
Thank you very much!! So frustrated... |
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b*******0
发帖数: 125 | 47 以前实验室做qPCR 用的是 heat sealing film，用光了。重新定的时候定成了 那种
self adhensive 的film（同一种牌子）。请问 这种情况 background calibration 是
不是重新来过？还是没必要？ |
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j*******n
发帖数: 8 | 48 各位亲，实验室要新买一台qPCR仪，本人没有经验，请教一下版上各位有经验认识这几
家公司的那个型号比较好用？bow！
BioRad Agilent, Applied Biosystems, Roche Applied Science |
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b*****o
发帖数: 150 | 49 Bio-rad 384 comes with a very good statistical software which directly
generates columns with standard error bars.The price is around 30K with free
plates and reagents (500 384 plates and 50ml Sybrgreen qPCR reagents) |
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l******g
发帖数: 1145 | 50 用过的ABI和eppendorf的都不错。
Biorad没用过，听说软件不易上手。貌似Biorad最近要推新一代的qpcr仪，真正意义上
的精确到copy number，可以关注一下。 |
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