A******r
发帖数: 121 | 1 首先谢谢大家的时间。因为自己是工程专业，没有生物背景，所以特来问问诸位经验丰
富的大侠们对此的看法。
实验大致上是用喷雾剂喷出一些virus stock suspension，接着用gelatin filter收集
这些带有病毒的小颗粒，然后把gelatin filter溶解在beef extract溶液中，最后用
infectivity assay测病毒的感染性，以及用qPCR测总共病毒的量。
照理qPCR测的是病毒DNA/RNA，而在雾化和空气传播过程中病毒又会失掉一些
infectivity，所以qPCR结果应该要比infectivity assay得到的值（TCID50或PFU）要
高，但是尝试了几种动物病毒和噬菌体之后，qPCR给出的结果都要比infectivity
assay要低（有的甚至低大于一个数量级）。
qPCR的standard curve就是用已知浓度的virus stock系列稀释之后做的。考虑过
gelatin filter和beef extract对viral nucleic acid extraction的影响，也做了几
个小实验验证了一下，发现是有一些影响，但是影响不是太大。做了infectivity
assay之后样本总是先放到-80 C存放，然后做qPCR的时候再解冻，不知道这多一个冰冻
/解冻过程影响大吗？又或者是TCID50精度太差，不适合用来做standard curve？
谢谢大家。望赐教。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 我的直觉就是你们可能没有在qPCR的时候做loading control
qPCR 的时候会因为样品制备和实验室试剂的差异而出现比较大的偏差，
所以一般需要一个内部control 来调整最后的值。对于你们这个实验，
是否可以考虑用host cell actin and GAPDH 来做loading control?
【在 A******r 的大作中提到】
: 首先谢谢大家的时间。因为自己是工程专业，没有生物背景，所以特来问问诸位经验丰
: 富的大侠们对此的看法。
: 实验大致上是用喷雾剂喷出一些virus stock suspension，接着用gelatin filter收集
: 这些带有病毒的小颗粒，然后把gelatin filter溶解在beef extract溶液中，最后用
: infectivity assay测病毒的感染性，以及用qPCR测总共病毒的量。
: 照理qPCR测的是病毒DNA/RNA，而在雾化和空气传播过程中病毒又会失掉一些
: infectivity，所以qPCR结果应该要比infectivity assay得到的值（TCID50或PFU）要
: 高，但是尝试了几种动物病毒和噬菌体之后，qPCR给出的结果都要比infectivity
: assay要低（有的甚至低大于一个数量级）。
: qPCR的standard curve就是用已知浓度的virus stock系列稀释之后做的。考虑过
|
A******r
发帖数: 121 | 3 谢谢。生物方面的合作者们估计嫌麻烦，没有同意。唉~
还是非常感谢你的建议。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我的直觉就是你们可能没有在qPCR的时候做loading control
: qPCR 的时候会因为样品制备和实验室试剂的差异而出现比较大的偏差，
: 所以一般需要一个内部control 来调整最后的值。对于你们这个实验，
: 是否可以考虑用host cell actin and GAPDH 来做loading control?
|
