O*********e
发帖数: 79 | 1 我一般用两到三个housekeeping gene，比如actin, GAPDH，做qRT-PCR的internal
control。分析数据的时候，我分别用这几个gene来计算我的experimental genes的
fold change，然后取平均值得到最终结果。今天在网上找到一个分析qRT-PCR结果的
Excel模板，它里面的计算方法是，先把housekeeping gene的Ct value取平均值，再用
这个平均值来计算experimental genes的fold change。这两种方法最后得到的结果是
一致的吗？这貌似是个数学问题，而我每每遇到数学就头晕，所以上来问问大家的看法
，还有大家平时都用的哪种算法？先谢谢了！ |
f*********r
发帖数: 1233 | 2 网上模板的算法肯定不对。
但算法不对，不一定结果就不一致。
打个比方。两个数字求几何平均。如果用了错误的方法（比如算术平均、对数平均...
），不一定就和几何平均有太大偏差。关键看这几个数字差别有多大。差别越大，不同
算法的结果相差越大。
详细解释会很花篇幅，以后有机会慢慢讲。 |
O*********e
发帖数: 79 | 3 多谢回复，看来我还是得老老实实用数学公式算算了
问题是这个不是网上随便找的模板，是SABiosience卖的SuperArray的数据分析模板。
它给的example里面那五个housekeeping genes的Ct值差别很大，从14.2到25。版上有
没有人用过SuperArray的？望指教:)
【在 f*********r 的大作中提到】
: 网上模板的算法肯定不对。
: 但算法不对，不一定结果就不一致。
: 打个比方。两个数字求几何平均。如果用了错误的方法（比如算术平均、对数平均...
: ），不一定就和几何平均有太大偏差。关键看这几个数字差别有多大。差别越大，不同
: 算法的结果相差越大。
: 详细解释会很花篇幅，以后有机会慢慢讲。
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f*********r
发帖数: 1233 | 4 公司给的模板大多有概念性错误。我不知道他们是真的不懂，还是故意简化计算，从而
让顾客容易上手，容易接受他们的产品。我上面说了，算法错误，不一定得不到接近正
确的计算结果。但条件是你的曲线非常理想。
【在 O*********e 的大作中提到】
: 多谢回复，看来我还是得老老实实用数学公式算算了
: 问题是这个不是网上随便找的模板，是SABiosience卖的SuperArray的数据分析模板。
: 它给的example里面那五个housekeeping genes的Ct值差别很大，从14.2到25。版上有
: 没有人用过SuperArray的？望指教:)
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k****o
发帖数: 589 | 5 呵呵，想起以前楼长给我解答的时候了。
Ct是幂指数，不能直接求算术平均的。应该是转化为模板的数量后再求算术平均。
不过只要你的样品duplicate或者triplicate的标准差不大，直接求算术平均出来的结
果也不会有质的区别。
个人对于qPCR的结果只相信平均1.5倍或以上的变化。在这个前提下，一般来说根据用两种方法算出的
结果，得到的判断都是一致的。
另外跑两个housekeeping个人觉得有点浪费试剂了。我觉得还是把扩增效率算得精确些
更有意义。 |
O*********e
发帖数: 79 | 6 嗯，我好像也记得版上有人详细讲过怎么正确的算平均。多谢了！
跑两到三个housekeeping不是为了减小误差。我的实验常常要对细胞进行处理，有时候
处理时间是几天，第一次做的时候我就会多跑几个housekeeping，然后选其中最稳定的
一个或者几个来做internal control。当然如果实验都熟悉了，后面就不用跑好几个
housekeeping了。 |
x****i
发帖数: 50 | 7 严格来讲有区别，但是很小。
真正区别大到不能忽略的程度，说明你的某个HKG被调控了，最好在两种算法中，都把
那个HKG去掉
【在 O*********e 的大作中提到】
: 我一般用两到三个housekeeping gene，比如actin, GAPDH，做qRT-PCR的internal
: control。分析数据的时候，我分别用这几个gene来计算我的experimental genes的
: fold change，然后取平均值得到最终结果。今天在网上找到一个分析qRT-PCR结果的
: Excel模板，它里面的计算方法是，先把housekeeping gene的Ct value取平均值，再用
: 这个平均值来计算experimental genes的fold change。这两种方法最后得到的结果是
: 一致的吗？这貌似是个数学问题，而我每每遇到数学就头晕，所以上来问问大家的看法
: ，还有大家平时都用的哪种算法？先谢谢了！
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o*****a
发帖数: 2335 | 8 这个Ct到底该怎么理解？是仪器测量值还是数学里的幂指数？我见的一个qPCR统计方法
的论文就是直接平均Ct。对测量值取平均抵消掉系统波动，再代入理论公式求浓度没什
么问题啊。
用两种方法算出的
【在 k****o 的大作中提到】
: 呵呵，想起以前楼长给我解答的时候了。
: Ct是幂指数，不能直接求算术平均的。应该是转化为模板的数量后再求算术平均。
: 不过只要你的样品duplicate或者triplicate的标准差不大，直接求算术平均出来的结
: 果也不会有质的区别。
: 个人对于qPCR的结果只相信平均1.5倍或以上的变化。在这个前提下，一般来说根据用两种方法算出的
: 结果，得到的判断都是一致的。
: 另外跑两个housekeeping个人觉得有点浪费试剂了。我觉得还是把扩增效率算得精确些
: 更有意义。
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d****t
发帖数: 139 | 9 yes, I used SABiosciences online software before. Of course, The Ct of
different HK genes varies big, but as long as it doesn't vary much between
samples for the same gene, it is a good internal control. It has 5 HK genes
on one plate, so you can choose the good ones as your control.
【在 O*********e 的大作中提到】
: 多谢回复，看来我还是得老老实实用数学公式算算了
: 问题是这个不是网上随便找的模板，是SABiosience卖的SuperArray的数据分析模板。
: 它给的example里面那五个housekeeping genes的Ct值差别很大，从14.2到25。版上有
: 没有人用过SuperArray的？望指教:)
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d****t
发帖数: 139 | 10 I remember it has been standardized that 3 housekeeping genes are required
for publication. Will give you the link tomorrow if i don't forget.
用两种方法算出的
【在 k****o 的大作中提到】
: 呵呵，想起以前楼长给我解答的时候了。
: Ct是幂指数，不能直接求算术平均的。应该是转化为模板的数量后再求算术平均。
: 不过只要你的样品duplicate或者triplicate的标准差不大，直接求算术平均出来的结
: 果也不会有质的区别。
: 个人对于qPCR的结果只相信平均1.5倍或以上的变化。在这个前提下，一般来说根据用两种方法算出的
: 结果，得到的判断都是一致的。
: 另外跑两个housekeeping个人觉得有点浪费试剂了。我觉得还是把扩增效率算得精确些
: 更有意义。
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d****t
发帖数: 139 | 11 There is a good free software for the calculation. It lets you choose
different models to fit your needs. I have it bookmarked on my computer at
work. I will give you the link tomorrow (if i don't forget ;)). |
d****t
发帖数: 139 | 12 Free software: https://esus.genome.tugraz.at/rtpcr/
MIQE guidelines: http://www.gene-quantification.de/miqe.html
www.biogazelle.com/papers/Bustin-2009-ClinicalChemistry.pdf |
k****o
发帖数: 589 | 13
required
对于top-tier杂志应该是这样的，但是众多10分以下的杂志往往不这么严格要求。假设
扩增效率为2的
文章实在是太多了。所以我对小于2倍的变化一般都持怀疑态度。
【在 d****t 的大作中提到】
: I remember it has been standardized that 3 housekeeping genes are required
: for publication. Will give you the link tomorrow if i don't forget.
:
: 用两种方法算出的
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