w******e
发帖数: 1187 | 1 怀疑自己的RT yield太低，有什么好方法测吗？PCR的话，可以dilute product直接
跟template比，RT之后要想定量只能qPCR，变数太多。
请指点。//bow |
T**********t
发帖数: 1604 | |
w******e
发帖数: 1187 | 3 用qPCR的话，RNA template定量，DNA standard curve point定量，RT,qPCR
都会引进误差，比较头疼。。。我现在用这种方法将就着，测出来的RT
yield只有10~20%:(
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我也只知道qPCR。
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 用picogreen assay呢？我没用过，不过我知道有用picogreen代替qPCR定量的。
【在 w******e 的大作中提到】
: 用qPCR的话，RNA template定量，DNA standard curve point定量，RT,qPCR
: 都会引进误差，比较头疼。。。我现在用这种方法将就着，测出来的RT
: yield只有10~20%:(
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a*****g
发帖数: 543 | 5
If the primer is okay, whey not q PCR anyway?
take a housekeeping gene, compare your RT product with others from the lab.
The Ct value shouldn't vary that much(less than 2 cycles if same amount and
quality of RNA are used as RT template)
【在 w******e 的大作中提到】
: 怀疑自己的RT yield太低，有什么好方法测吗？PCR的话，可以dilute product直接
: 跟template比，RT之后要想定量只能qPCR，变数太多。
: 请指点。//bow
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w******e
发帖数: 1187 | 6 it's mainly because my template is weird (a library of short random
sequences), so gene xcript won't be a good standard...
.
and
【在 a*****g 的大作中提到】
:
: If the primer is okay, whey not q PCR anyway?
: take a housekeeping gene, compare your RT product with others from the lab.
: The Ct value shouldn't vary that much(less than 2 cycles if same amount and
: quality of RNA are used as RT template)
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a*****g
发帖数: 543 | 7 I see.
One time I did try to use the PCR products as standard curve, it's not that
bad if you run a gel and purify the product. It's better to have lots of PCR
products though ( I used 160ul). what do you plan to use to measure the co
ncentration? Nanodrop or picogreen?
【在 w******e 的大作中提到】
: it's mainly because my template is weird (a library of short random
: sequences), so gene xcript won't be a good standard...
:
: .
: and
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w******e
发帖数: 1187 | 8 thank you for your suggestion. I do have some sort of standard points
for my PCR (i.e., I can quantitate my PCR product reasonablly well).
However, if I don't have a way to accurately measure the amount of starting
RNA template, the whole thing wouldn't make sense.
right now, I use nanodrop to measure the template (which is short ssRNA),
and the standard points (which is short ssDNA). do you have any suggestion
on quantifying the amount more accurately? If I can nail these two,
the yield is easy
【在 a*****g 的大作中提到】
: I see.
: One time I did try to use the PCR products as standard curve, it's not that
: bad if you run a gel and purify the product. It's better to have lots of PCR
: products though ( I used 160ul). what do you plan to use to measure the co
: ncentration? Nanodrop or picogreen?
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w******e
发帖数: 1187 | 9 多谢信息。我看了眼picogreen，可惜不能用在ssRNA上。最初的template定量
始终是个问题。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 用picogreen assay呢？我没用过，不过我知道有用picogreen代替qPCR定量的。
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 qRT-PCR？google到的，没用过：
http://www.promega.com/guides/rna_guide/quantifyingrna_qpcr.pdf
【在 w******e 的大作中提到】
: 多谢信息。我看了眼picogreen，可惜不能用在ssRNA上。最初的template定量
: 始终是个问题。
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w******e
发帖数: 1187 | 11 感觉要做这个就得知道RT的yield，chicken and egg...
【在 T**********t 的大作中提到】
: qRT-PCR？google到的，没用过：
: http://www.promega.com/guides/rna_guide/quantifyingrna_qpcr.pdf
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 最初的模板量用nanodrop定量不够么？
【在 w******e 的大作中提到】
: 感觉要做这个就得知道RT的yield，chicken and egg...
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w******e
发帖数: 1187 | 13 总还是觉得心理别扭。。。或者说是鸵鸟心理，因为如果假设：1.nanodrop定量
RNA/DNA library没问题；2.qPCR efficiency没问题（这个应该没问题，从
standard上来看）；那我的RT yield就铁定是10～20％了。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 最初的模板量用nanodrop定量不够么？
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T**********t
发帖数: 1604 | 14 呵呵，原来是这么回事。确实如果不用其他方法double check一下是不甘心的。
我自己没做过RNA library，我们实验室有人做的，改天我帮你问一下好了。不过我很
怀疑他们估计都不去算yield的。
【在 w******e 的大作中提到】
: 总还是觉得心理别扭。。。或者说是鸵鸟心理，因为如果假设：1.nanodrop定量
: RNA/DNA library没问题；2.qPCR efficiency没问题（这个应该没问题，从
: standard上来看）；那我的RT yield就铁定是10～20％了。。。
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w******e
发帖数: 1187 | 15 可不是嘛。。。多谢啦！
【在 T**********t 的大作中提到】
: 呵呵，原来是这么回事。确实如果不用其他方法double check一下是不甘心的。
: 我自己没做过RNA library，我们实验室有人做的，改天我帮你问一下好了。不过我很
: 怀疑他们估计都不去算yield的。
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