m**********d
发帖数: 137 | 1 新设计了primer，扩增genomic DNA的某片段，170bp左右，用qPCR来定量，primer退火
温度已测好，57°C
用SYBR green做qPCR，SYBR新从BioRad订的
25μl total volume
12.5μl SYBR green master mix + 0.1μl primerF (0.1μM in the fianl
concentration)+ 0.1μl primerR + 50ng genomic DNA + H2O fill up to 25μl
用的PCR program如下：
95°C 10min + (95°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) 40cycle + dissociation
curve
72°C elongation step读数
结果没有任何信号，dissociation curve当然也没信号或者有一些非常弱且杂乱的信号
我把sample拿出来，跑了个2%agar gel，结果非常清晰干净的一条带，size完全正确，
看不到primer dimer或者其他non-specific band
qPCR怎么回事呢，我是新手，没啥经验，请高手们指点指点，多谢 |
X***n
发帖数: 366 | 2 Are you sure you used SYBR as probe? Have you set ROX as reference? |
c******r
发帖数: 3778 | 3 问一句，你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
sybr mix是多少乘的？
另外你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？ |
f*********r
发帖数: 1233 | 4 我替楼主回答这些问题:
你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
答：是EB
sybr mix是多少乘的？
答：2x
你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？
答：55-95度。每个梯度0.5度，共80个梯度。
【在 c******r 的大作中提到】
: 问一句，你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
: sybr mix是多少乘的？
: 另外你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？
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c******r
发帖数: 3778 | 5 哦，那跑完SYBR PCR能不能直接跑胶，不要用EB？
一般UV应该可以看到条带的。如果直接看SYBR看不到，再用EB染一下，如果能看到，说
明SYBR有问题。
【在 f*********r 的大作中提到】
: 我替楼主回答这些问题:
: 你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
: 答：是EB
: sybr mix是多少乘的？
: 答：2x
: 你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？
: 答：55-95度。每个梯度0.5度，共80个梯度。
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c*********y
发帖数: 1952 | 6 一个最愚蠢的出错可能，也是一个我好几个学生都出过错的情况：
PCR tube的位置和激光采样的位置不一样。
所以，PCR反应很好，激光采样啥也没有。 |
m**********d
发帖数: 137 | 7 double check了，位置没load错
实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
detector坏掉了
还有别的啥可能么
【在 c*********y 的大作中提到】
: 一个最愚蠢的出错可能，也是一个我好几个学生都出过错的情况：
: PCR tube的位置和激光采样的位置不一样。
: 所以，PCR反应很好，激光采样啥也没有。
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c*********y
发帖数: 1952 | 8 filter选错的可能性应该很小。
【在 m**********d 的大作中提到】
: double check了，位置没load错
: 实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
: detector坏掉了
: 还有别的啥可能么
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m**********d
发帖数: 137 | 9 问了一圈人，可能是pPCR machine跟reagent不compatible
实验室的qPCR仪是ABI 7300，订的是bio-rad的SYBR,据说要想用这个机器需要另加ROX
，或者换到ABI7900机器，或者从ABI订SYBR green(has ROX in it)
dissociation
【在 m**********d 的大作中提到】
: 新设计了primer，扩增genomic DNA的某片段，170bp左右，用qPCR来定量，primer退火
: 温度已测好，57°C
: 用SYBR green做qPCR，SYBR新从BioRad订的
: 25μl total volume
: 12.5μl SYBR green master mix + 0.1μl primerF (0.1μM in the fianl
: concentration)+ 0.1μl primerR + 50ng genomic DNA + H2O fill up to 25μl
: 用的PCR program如下：
: 95°C 10min + (95°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) 40cycle + dissociation
: curve
: 72°C elongation step读数
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c******r
发帖数: 3778 | 10 嗨，如果这个问题好解决。
7300用ROX做internal reference。bio-rad没有ROX。不过没关系，7300可以调设置，
直接把ROX的reading去掉就可以了。你看看manual，自己设个新的program，不用ROX就
可以了，不用换reagent。
ROX
【在 m**********d 的大作中提到】
: 问了一圈人，可能是pPCR machine跟reagent不compatible
: 实验室的qPCR仪是ABI 7300，订的是bio-rad的SYBR,据说要想用这个机器需要另加ROX
: ，或者换到ABI7900机器，或者从ABI订SYBR green(has ROX in it)
:
: dissociation
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