h**********d
发帖数: 30 | 1 基本情况：
E.coli C43, cyoABCDE knockout(Km)表达cytochrome bo3, tyrA knockout(Cm)
tyrosine生物
合成中的一个酶（从prehenate到4-hydroxy-phenylpyruvate)
pAc-YNH2 plasmid(Tet): proK promoter + 6 copy of M.j tyrosine tRNA, glnS
promoter
+ 3-aminno-tyrosine M.j tRNA synthase (M.j is an archea strain)
pET plasmid(Amp): T7 cyoABCDE w/ cyoB Y288Amber stop codon mutation
要表达的是cytochrome bo3 mutant protein, 在蛋白里genetically引入一个非天然氨
基酸
（peter schultz组的技术，pAc-YNH2质粒也是从他们组拿给MIT的STUBBE组做的，她们
组没遇
到过这个质粒的问题）
这两个质粒同时存在于E.coli c43里的时 |
h**********d
发帖数: 30 | |
m****m
发帖数: 395 | 3 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
K*F
发帖数: 120 | 4 bo3的mutant是否functional？双质粒表达要注意你的pET质粒的细胞丰度。good luck |
g*****y
发帖数: 6325 | 5 Amp很容易被细菌secret的酶降解,时间长了，虽然你可以分离 质粒，但是有可能 你的
表达vector的细胞被稀释，蛋白浓度降低， 跑胶也无法detect. 换成kan 的菌株试
试。 |
h**********d
发帖数: 30 | 6 恩，多谢前辈。我知道AMP是被开环分解的，而TET是细胞EFLUX的原理，浓度不会有太
大变化，一
般我不会让细菌长超过一天，否则我会追加五分之一或者二分之一的AMP，所以我想应
该不是这个
问题。之前我还有一些单质粒的体系，只有PET质粒，蛋白的表达式非常高的，我唯一
能想到的应
该就是这个双质粒变种的PET质粒不如那几个单质粒PET质粒的诱发性好，因为我每次用
的是严格
一致的表达条件。
BTW,我的GENOME上有KM和CM的抗药性，所以没法再在质粒里换抗药性了~
【在 g*****y 的大作中提到】
: Amp很容易被细菌secret的酶降解,时间长了，虽然你可以分离 质粒，但是有可能 你的
: 表达vector的细胞被稀释，蛋白浓度降低， 跑胶也无法detect. 换成kan 的菌株试
: 试。
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h**********d
发帖数: 30 | 7 funtional,但是当然是比WT还原氧气的活性要低，每次得到蛋白，我会从光谱看SORET+
ALPHA
BAND，用PAGE看4个亚基，用HPLC测醌和HEME的比例，最后ICP-OES表征一遍蛋白的铜和
铁含量，
应该都是正常FOLDING的蛋白，CW-EPR,RAMAN光谱的数据也都会告诉我蛋白是否正常。
烦请前辈能告知一下PET质粒的浓度在MINI PREP后多少为宜呢？比如5ML的OVERNITE
CULTURE，按
照我的经历，这个双质粒体系两个在一起如果用50微升洗脱，质粒总浓度在50到100ng/
uL之间，
而且每次PET都比PAC的条带看起来更亮一些。
多谢了
luck
【在 K*F 的大作中提到】
: bo3的mutant是否functional？双质粒表达要注意你的pET质粒的细胞丰度。good luck
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h**********d
发帖数: 30 | 8 好的，我也只好一个一个条件慢慢尝试了。
我是让colony在2YT里长到饱和（1.5到两天）后转入M63培养基的，这个以前也是成功
的，并
且是参照文献上类似工作做的。我一般都是从板上挑最大的几个菌落开始长，当然它们
也是长
得最快的。开始诱导都是在E.COLI进入600纳米吸收值0.6到0.7之间（我个人觉得OD高
一些有
利于细胞内低GLUCOSE，高cAMP两个条件满足引发表达，是这样么？）。
我从来没尝试过降低温度表达，因为实验室用的E.COLI C43是专门优化表达细胞色素氧
化酶这
类的膜蛋白的，我这次打算用37，30，25都尝试一下？
诱导后一半长菌4个小时，久了会形成干扰的杂质蛋白CYTOCHROME OO3,大概1，两个小
时黄色
的E.COLI就会开始变红，意味着蛋白已经积累到可以目测的程度了。
蛋白的纯化我到不担心，这个在组里已经是很常规的步骤了，首先它都在膜里的，不会
在清液
中，其次有没有蛋白从颜色就可以看出来，棕红的细胞膜就对了，呵呵。
【在 m****m 的大作中提到】
: 膜蛋白难表达是很正常的事。
: 先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
: 个疑问。
: 关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
: 先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
: 菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
: 开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
: 更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
: 一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
: 白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
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g*****y
发帖数: 6325 | 9 如果IPTG不好用，试一下autoinduction。 还有你追加Amp一点用也没有，media里的酶
很快就全部掉了。你必须
centrifuge down cell, 加入新的medium.
【在 h**********d 的大作中提到】
: 恩，多谢前辈。我知道AMP是被开环分解的，而TET是细胞EFLUX的原理，浓度不会有太
: 大变化，一
: 般我不会让细菌长超过一天，否则我会追加五分之一或者二分之一的AMP，所以我想应
: 该不是这个
: 问题。之前我还有一些单质粒的体系，只有PET质粒，蛋白的表达式非常高的，我唯一
: 能想到的应
: 该就是这个双质粒变种的PET质粒不如那几个单质粒PET质粒的诱发性好，因为我每次用
: 的是严格
: 一致的表达条件。
: BTW,我的GENOME上有KM和CM的抗药性，所以没法再在质粒里换抗药性了~
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h**********d
发帖数: 30 | 10 谢谢提醒！下次一定注意。你是说因为细胞很浓，追加的AMP很快也被环酯酶给破坏了
吧？
【在 g*****y 的大作中提到】
: 如果IPTG不好用，试一下autoinduction。 还有你追加Amp一点用也没有，media里的酶
: 很快就全部掉了。你必须
: centrifuge down cell, 加入新的medium.
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g*****y
发帖数: 6325 | 11 是啊，是ecoli细胞分泌到溶液里的，你加amp都很快降解，所以必须沉淀细胞加新溶液
。 一半用amp的vector induce ,我
都不会培养超过12小时.
【在 h**********d 的大作中提到】
: 谢谢提醒！下次一定注意。你是说因为细胞很浓，追加的AMP很快也被环酯酶给破坏了
: 吧？
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