A****7
发帖数: 91 | 1 在tranformation时，为何一个bacteria colony只能take 一种 质粒，而不是一种以上
？（我们做一堆不同的质粒pool transformation）
哪里可以找到原理啊？多谢了！！ |
j****n
发帖数: 3370 | 2 Plasmid incompatibility?
【在 A****7 的大作中提到】
: 在tranformation时，为何一个bacteria colony只能take 一种 质粒，而不是一种以上
: ？（我们做一堆不同的质粒pool transformation）
: 哪里可以找到原理啊？多谢了！！
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s******y
发帖数: 28562 | 3 完全可以作到一种以上的呀，只要你用两个不同的标记来同时筛选。
但是因为tranformation本身就是一个小概率事情，所以同时被转染两个质粒的概率会
很小就是了。
【在 A****7 的大作中提到】
: 在tranformation时，为何一个bacteria colony只能take 一种 质粒，而不是一种以上
: ？（我们做一堆不同的质粒pool transformation）
: 哪里可以找到原理啊？多谢了！！
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m**********2
发帖数: 6568 | 4 楼上才是正解。
现在这种古老知识是不是课本不教了，只有53俱乐部的才知道直隶不兼容性？
【在 s******y 的大作中提到】
: 完全可以作到一种以上的呀，只要你用两个不同的标记来同时筛选。
: 但是因为tranformation本身就是一个小概率事情，所以同时被转染两个质粒的概率会
: 很小就是了。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 汗，的确不记得这回事情了。主要是我们都会用抗体来强迫细菌同时保留两个质粒，所
以一般都没有什么问题。
【在 m**********2 的大作中提到】
: 楼上才是正解。
: 现在这种古老知识是不是课本不教了，只有53俱乐部的才知道直隶不兼容性？
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h**********r
发帖数: 671 | 6 得要不同类型的复制起点，不完全是抗生素。不然会质粒不兼容。 |
v**********m
发帖数: 5516 | 7 两类plasmid竞争使用宿主复制机器的结果，短序列的那个会胜出。如果用两个不同的
抗生素压力，可以在一个细胞里同时保留两类plasmid好多代，但拷贝数到最后肯定不
是1：1，而且细菌生长受不良影响。
【在 h**********r 的大作中提到】
: 得要不同类型的复制起点，不完全是抗生素。不然会质粒不兼容。
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U******m
发帖数: 2349 | 8 这个是正解。抗生素只是保持质粒不丢失。
【在 h**********r 的大作中提到】
: 得要不同类型的复制起点，不完全是抗生素。不然会质粒不兼容。
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h**********r
发帖数: 671 | 9 大家常用的表达蛋白的 E. coli Rosetta(DE3) 系列，氯霉素就是维持P15 ori的质粒
的，这个质粒上装了一些稀有的tRNA。没钱搞基因合成的，可以把这个装到自己感兴趣
的宿主菌里面，可能有助于基因表达。 |
E*****e
发帖数: 417 | 10 If two plasmids or three plasmids are compatible (different antibiotic
markers and incompatibility groups), you can transform them into the same
host at the same time using plates containing all needed antibiotics.
上？（我们做一堆不同的质粒pool transformation）
【在 A****7 的大作中提到】
: 在tranformation时，为何一个bacteria colony只能take 一种 质粒，而不是一种以上
: ？（我们做一堆不同的质粒pool transformation）
: 哪里可以找到原理啊？多谢了！！
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h**********r
发帖数: 671 | 11 不过想想还是挺神奇的，就一个碱基的区别，竟然也能识别出来。 |
c**i
发帖数: 265 | 12 Rosetta的稀少tRNA不是整合到基因组么？
【在 h**********r 的大作中提到】
: 大家常用的表达蛋白的 E. coli Rosetta(DE3) 系列，氯霉素就是维持P15 ori的质粒
: 的，这个质粒上装了一些稀有的tRNA。没钱搞基因合成的，可以把这个装到自己感兴趣
: 的宿主菌里面，可能有助于基因表达。
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h**********r
发帖数: 671 | 13 在pACYC质粒上吧。
Rosetta(DE3) This is a BL21 derivative designed to enhance the expression of
eukaryotic proteins that contain codons rarely used in E. coli. These
strains supply tRNA genes for AGG/AGA (Arg), AUA (Ile), CUA (Leu), CCC (Pro)
and GGA (Gly) on a ColE1 compatible chloramphenicol-resistant plasmid. Thus
the Rosetta strains provide for "universal" translation which is otherwise
limited by the codon usage of E. coli.
Available from Novagen |
n*********e
发帖数: 180 | 14 你这个问题问得非常好。这个bacterial colony只能take一种质粒纯粹是分子克隆作者
的谣传。
根本就不是这么回事。我原来做recombineering的时候需要将一个质粒的一部分切掉形
成一个新的质粒。但是因为不是每个质粒都被切，最后拿到的是一个混合物。由于两个
质粒都特别大，相差的片段也很短，没法通过跑胶分开。所以我就想到了这个质粒不相
容原理。结果试了一下完全是bull shit。无论怎么反复稀释transformation拿新的
colony，发现这两个质粒都在一起。最后只好把质粒切成片段，回收重新ligate才解决
这个问题。
【在 A****7 的大作中提到】
: 在tranformation时，为何一个bacteria colony只能take 一种 质粒，而不是一种以上
: ？（我们做一堆不同的质粒pool transformation）
: 哪里可以找到原理啊？多谢了！！
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z*f
发帖数: 27 | 15 质粒不兼容是简化的说法，很多同学不动脑，误解了。 |
H*******i
发帖数: 196 | 16 如果不同质粒使用相同方法控制在e.coli里的复制还有数量得话，那么这两种质粒就容
易出现兼容性问题（数量是不稳定的）
e.coli里最常用的三个分属不同体系的ori是PMB1,p15A,pSC101
其他还有几个常用的，不过我一般用那三种，使用三种不同抗性，没啥问题
其他bacteria原理应该是一样的，不过ori应该有些区别。
这种内容随便搜点关键词就能找到答案，或者去公开的一些实验wiki也有介绍
另外LS某同学提到用不兼容原理来分隔质粒，好歹你质粒选择压力要相差很大才行。不
然十几到几十甚至几百copy的质粒想要只有一种，哪有那么容易。。
我曾经试过去除ecoli中的质粒，十分困难，也不知道是不是我方法不对。。 |
h**********r
发帖数: 671 | 17 yeast能同时转同时转两个CEN/ARS的质粒吗？当然用不同的marker.按道理CEN型的可以
像基因组那样复制。 |
j****n
发帖数: 3370 | 18 可以 酵母没有不兼容的问题
【在 h**********r 的大作中提到】
: yeast能同时转同时转两个CEN/ARS的质粒吗？当然用不同的marker.按道理CEN型的可以
: 像基因组那样复制。
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H****N
发帖数: 997 | 19 正解
【在 s******y 的大作中提到】
: 完全可以作到一种以上的呀，只要你用两个不同的标记来同时筛选。
: 但是因为tranformation本身就是一个小概率事情，所以同时被转染两个质粒的概率会
: 很小就是了。
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H****N
发帖数: 997 | 20 This actually has to do with formation of plamid concatemers. Re-
transformation does not always solve the problem. You can simply linearize (
monomerize), re-ligate, and re-transform to separate them.
【在 n*********e 的大作中提到】
: 你这个问题问得非常好。这个bacterial colony只能take一种质粒纯粹是分子克隆作者
: 的谣传。
: 根本就不是这么回事。我原来做recombineering的时候需要将一个质粒的一部分切掉形
: 成一个新的质粒。但是因为不是每个质粒都被切，最后拿到的是一个混合物。由于两个
: 质粒都特别大，相差的片段也很短，没法通过跑胶分开。所以我就想到了这个质粒不相
: 容原理。结果试了一下完全是bull shit。无论怎么反复稀释transformation拿新的
: colony，发现这两个质粒都在一起。最后只好把质粒切成片段，回收重新ligate才解决
: 这个问题。
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