H****s
发帖数: 301 | 1 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
很容易就克隆到真核表达载体里去。
尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
（原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
）使用GroES的leader peptide试试看。
各位有没有什么建议？谢谢。 |
e****s
发帖数: 1125 | 2 感觉还是不能排除是克隆的问题。
载体不同，Ligation效率会差别很大。
要是没试过的话，可以试试看从那个真核载体里切出来，再克隆到原核载体里去。比
PCR片段直接克隆容易些。
你说的毒性问题，我个人认为可能性很小。可能我做的比较少，还没遇见过这样的情况。
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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m**z
发帖数: 787 | 3 用BL21做克隆？不太可行吧？克隆应该还是在DH5a等类似的里面。在这些e.coli里面没
有leaky expression的问题，只有BL21才有这个问题吧
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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r**e
发帖数: 20 | 4 我感觉好像也是克隆的问题 , 不觉得leak expression 能这么厉害
原因可能是你的原核载体酶切处理得不好
你当然可以试试DH5a. ^^
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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Z******5
发帖数: 435 | 5 同意楼上，试试DH5a， TOP10等菌株。 过了这一步才能确认是不是对细菌有毒性。 |
H****s
发帖数: 301 | 6 I have tried DH5a/Top10/XL-1blue and it did not work neither.
I am very sure that there is no problem with my cut vector because I used it
to do library of huge size and never got any problem. I routinely use this
vector and same restriction sites for library cloning and never failed.
To make sure it is not cloning problem, I also did another control ligation.
Using the same materials, I ligated GFP fragment into the vector and got
tons of green colonies after induction. From the GFP control experiment, I
know that my vector is clean cut.
Any suggestions?
【在 Z******5 的大作中提到】
: 同意楼上，试试DH5a， TOP10等菌株。 过了这一步才能确认是不是对细菌有毒性。
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m**z
发帖数: 787 | 7 you vector is clean cut, but what about your insert? In these strains, there
shouldn't be any leaky expression...
it
this
ligation.
【在 H****s 的大作中提到】
: I have tried DH5a/Top10/XL-1blue and it did not work neither.
: I am very sure that there is no problem with my cut vector because I used it
: to do library of huge size and never got any problem. I routinely use this
: vector and same restriction sites for library cloning and never failed.
: To make sure it is not cloning problem, I also did another control ligation.
: Using the same materials, I ligated GFP fragment into the vector and got
: tons of green colonies after induction. From the GFP control experiment, I
: know that my vector is clean cut.
: Any suggestions?
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H****s
发帖数: 301 | 8 I cloned the same insert into mammalian expression vector (same restriction
sites) and did not get a problem, which indicates the insert is clean cut
too. In addition, the quality of insert was check by agarose gel
electrophoresis.
there
【在 m**z 的大作中提到】
: you vector is clean cut, but what about your insert? In these strains, there
: shouldn't be any leaky expression...
:
: it
: this
: ligation.
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C***N
发帖数: 200 | 9 载体的酶切位点是否是甲基化敏感的？建议在dam-的E coli里提载体，再酶切，连接。
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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g*****y
发帖数: 6325 | 10 克隆是不能用bl21(de3)的。这个菌株有end3基因表达, 你用来测序的miniprep DNA很
容易被这个酶降解。推荐卖
bl21(DE3)gold. 这个菌株end3已经knock out了。
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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Z******5
发帖数: 435 | 11 你用的啥载体啊？ 比如PET有几个常用的载体，比如28a，30a，32a等，都试试。 或者
比如你用32a，可以先试试连到32b，32c里面，然后做亚克隆。
乱说的。 尝试一下也无妨。 |
Z******5
发帖数: 435 | 12 "比如你用32a，可以先试试连到32b，32c里面，然后做亚克隆。"
这个实验应该可以确认到底是不是leaky expression导致的了。
应该做一下 |
s********n
发帖数: 2939 | 13 你可以试试pETcoco载体；实在不行就换其他的promoter，比如如pBAD。 |
s********s
发帖数: 67 | 14 如果毒性这么强，克隆的片段应该是一个酶吧？做几个突变试试？ 我以前碰到过毒性
蛋白，但和你的情况不一样，我是诱导之后宿主马上不生长，各种低温条件都试过。
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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h**********8
发帖数: 650 | 15 猛男，你先用TOP10搞清楚质粒，再去BL21表达蛋白
DE3
（2
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
: （原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
: 是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
: 我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
: ）使用GroES的leader peptide试试看。
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n***w
发帖数: 2405 | 16 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？ |
m******5
发帖数: 1383 | 17 该转录因子多大，你试过哪些质粒
常用质粒都轮一遍，常常就能出奇迹
还有，试过不一样的培养基么
【在 n***w 的大作中提到】
: 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
: 我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
: overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
: gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
: chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
: 现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？
|
n***w
发帖数: 2405 | 18 嘿，是你。
转录因子，连上fusion的部分，就2.4kb。
我就连在了pGEX-2T系列上，因为要做表达用，当然还用过TA vector。。。
培养基一开始用LB，后来照manual里用了YTA，其实和LB差不多。。。
我大概知道是什么原因了，我想换真核表达系统试试。。。
谢谢。
【在 m******5 的大作中提到】
: 该转录因子多大，你试过哪些质粒
: 常用质粒都轮一遍，常常就能出奇迹
: 还有，试过不一样的培养基么
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m******5
发帖数: 1383 | 19 该转录因子多大，你试过哪些质粒
常用质粒都轮一遍，常常就能出奇迹
还有，试过不一样的培养基么
【在 n***w 的大作中提到】
: 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
: 我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
: overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
: gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
: chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
: 现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？
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m******5
发帖数: 1383 | 20 2.4 kb够大的了 …………
很多pGEX不work的东西放到pet28a里work得很好
另外，你如果能拿到主带只是很少的话建议全程低温(18c)
【在 n***w 的大作中提到】
: 嘿，是你。
: 转录因子，连上fusion的部分，就2.4kb。
: 我就连在了pGEX-2T系列上，因为要做表达用，当然还用过TA vector。。。
: 培养基一开始用LB，后来照manual里用了YTA，其实和LB差不多。。。
: 我大概知道是什么原因了，我想换真核表达系统试试。。。
: 谢谢。
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n***w
发帖数: 2405 | 21 嗯。我用的是22度。。。
【在 m******5 的大作中提到】
: 2.4 kb够大的了 …………
: 很多pGEX不work的东西放到pet28a里work得很好
: 另外，你如果能拿到主带只是很少的话建议全程低温(18c)
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w**t
发帖数: 52 | 22 我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation，
应该是codon bias的问题，用Rossetta能好一些。
或者换insect cell。 |
n***w
发帖数: 2405 | 23 can you recommend some companies?
Thank you.
【在 w**t 的大作中提到】
: 我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation，
: 应该是codon bias的问题，用Rossetta能好一些。
: 或者换insect cell。
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h**********8
发帖数: 650 | 24 你的问题我遇到过，几乎一模一样。
用的rossetta, 换了个培养基2yt，温度降到20度， iptg 降到0.2, ok 了。
【在 n***w 的大作中提到】
: 嗯。我用的是22度。。。
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