d********e
发帖数: 321 | 1 想看看蛋白A是否和蛋白B 结合，蛋白A有个myc tag, 蛋白B没有任何tag. 所以IP的时候
就是用anti-myc (9E10)来 pull down蛋白complex，然后用anti-B抗体做WB。
我的negative control 是只表达B蛋白的细胞（没有A蛋白转染表达），这个negative
control 在WB上看不到B，也就是说B和anti-myc抗体或agarose beads 没有 non-speci
fic interaction. 我觉得这个阴性对照是合理的。
可是老板今天非要说这是个 bullshit negative control, you should use mutant pr
oteins (known for no interaction with each other) as negative control.
我听了之后，真TMD要发疯了，这两个蛋白连是否有interaction的确凿证据都没有，我
怎么知道要突变哪里才能导致这A和B没有interaction?
大家说说我的negative control合理吗？老板的问题是不是很白痴？ |
l*****a
发帖数: 1431 | |
d********e
发帖数: 321 | 3 这么说我老板的问题很白痴了？
明天找他继续理论。真开始鄙视it了
【在 l*****a 的大作中提到】
: 你的ｃｏｎｔｒｏｌ合理
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r*****m
发帖数: 231 | |
c******r
发帖数: 3778 | 5 你老板这个显然胡扯。
但是你的control也是不够的。
better control是表达myc tag和B，这样可以排除B和myc tag有interaction。
当然还有什么Isotype control啥的，我想你应该已经做了。
时候
negative
speci
pr
【在 d********e 的大作中提到】
: 想看看蛋白A是否和蛋白B 结合，蛋白A有个myc tag, 蛋白B没有任何tag. 所以IP的时候
: 就是用anti-myc (9E10)来 pull down蛋白complex，然后用anti-B抗体做WB。
: 我的negative control 是只表达B蛋白的细胞（没有A蛋白转染表达），这个negative
: control 在WB上看不到B，也就是说B和anti-myc抗体或agarose beads 没有 non-speci
: fic interaction. 我觉得这个阴性对照是合理的。
: 可是老板今天非要说这是个 bullshit negative control, you should use mutant pr
: oteins (known for no interaction with each other) as negative control.
: 我听了之后，真TMD要发疯了，这两个蛋白连是否有interaction的确凿证据都没有，我
: 怎么知道要突变哪里才能导致这A和B没有interaction?
: 大家说说我的negative control合理吗？老板的问题是不是很白痴？
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d********e
发帖数: 321 | 6 myc tag is so small, and I think it's hard to see it on WB.
I didn't do isotype control, maybe I should. thanks for all the suggestions.
【在 c******r 的大作中提到】
: 你老板这个显然胡扯。
: 但是你的control也是不够的。
: better control是表达myc tag和B，这样可以排除B和myc tag有interaction。
: 当然还有什么Isotype control啥的，我想你应该已经做了。
:
: 时候
: negative
: speci
: pr
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c******r
发帖数: 3778 | 7 嗯？
我是说在negative control里面表达myc tag和B，然后pull down myc，wb for B。这
样你的negative和AB同时表达更接近，比仅仅没有A做negative control可能更好一点
。你觉得怎么样？
suggestions.
【在 d********e 的大作中提到】
: myc tag is so small, and I think it's hard to see it on WB.
: I didn't do isotype control, maybe I should. thanks for all the suggestions.
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d********e
发帖数: 321 | 8 that makes sense. I was thinking of probing myc after WB for B on the same
membrane.
【在 c******r 的大作中提到】
: 嗯？
: 我是说在negative control里面表达myc tag和B，然后pull down myc，wb for B。这
: 样你的negative和AB同时表达更接近，比仅仅没有A做negative control可能更好一点
: 。你觉得怎么样？
:
: suggestions.
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d****u
发帖数: 1553 | 9 其实最好的control应该是在负对照里加一个有myc tag的蛋白比如GFP啊啥的。最好要
和你的sample是相同的质粒只不过蛋白不同，然后做IP。保证能封住所有reviewer的嘴 |
c******r
发帖数: 3778 | 10 嗯，这个确实更好。但是用GFP有个问题，GFP非常稳定，一般表达量会比较高，不知道
会不会false positive。
你这个idea是对的，不过找什么可能还需要考虑一下。
【在 d****u 的大作中提到】
: 其实最好的control应该是在负对照里加一个有myc tag的蛋白比如GFP啊啥的。最好要
: 和你的sample是相同的质粒只不过蛋白不同，然后做IP。保证能封住所有reviewer的嘴
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d****u
发帖数: 1553 | 11 扔个luciferase基因吧，一般的哺乳动物细胞里也没有底物。
【在 c******r 的大作中提到】
: 嗯，这个确实更好。但是用GFP有个问题，GFP非常稳定，一般表达量会比较高，不知道
: 会不会false positive。
: 你这个idea是对的，不过找什么可能还需要考虑一下。
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g*********5
发帖数: 2533 | 12 you could try express myc-A, AND Aliquot cell lysate then use myc-antibody
or corresponding igG as control?
时候
negative
speci
pr
【在 d********e 的大作中提到】
: 想看看蛋白A是否和蛋白B 结合，蛋白A有个myc tag, 蛋白B没有任何tag. 所以IP的时候
: 就是用anti-myc (9E10)来 pull down蛋白complex，然后用anti-B抗体做WB。
: 我的negative control 是只表达B蛋白的细胞（没有A蛋白转染表达），这个negative
: control 在WB上看不到B，也就是说B和anti-myc抗体或agarose beads 没有 non-speci
: fic interaction. 我觉得这个阴性对照是合理的。
: 可是老板今天非要说这是个 bullshit negative control, you should use mutant pr
: oteins (known for no interaction with each other) as negative control.
: 我听了之后，真TMD要发疯了，这两个蛋白连是否有interaction的确凿证据都没有，我
: 怎么知道要突变哪里才能导致这A和B没有interaction?
: 大家说说我的negative control合理吗？老板的问题是不是很白痴？
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