s******s
发帖数: 55 | 1 试了很多条件，用qiagen的gel extraction试剂盒在220nm处总会有吸收峰，
absorbance强度在2.0左右 (nanodrop) 。
网上查了一下据说是盐没有除干净，但是试了两次PE wash和加PE后放置更长时间，都
没有改善。
请教有什么方法可以去掉这个220nm吸收？ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 我通常gel extration以后，再过一遍miniElute或者普通的PCR purification
【在 s******s 的大作中提到】
: 试了很多条件，用qiagen的gel extraction试剂盒在220nm处总会有吸收峰，
: absorbance强度在2.0左右 (nanodrop) 。
: 网上查了一下据说是盐没有除干净，但是试了两次PE wash和加PE后放置更长时间，都
: 没有改善。
: 请教有什么方法可以去掉这个220nm吸收？
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l******a
发帖数: 3339 | 3 一般没事儿，非要较真，用pcr purification kit再纯化一边，会sacrifice yeild.
【在 s******s 的大作中提到】
: 试了很多条件，用qiagen的gel extraction试剂盒在220nm处总会有吸收峰，
: absorbance强度在2.0左右 (nanodrop) 。
: 网上查了一下据说是盐没有除干净，但是试了两次PE wash和加PE后放置更长时间，都
: 没有改善。
: 请教有什么方法可以去掉这个220nm吸收？
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l******g
发帖数: 1145 | |
s******s
发帖数: 55 | |
s*******e
发帖数: 1389 | 6 搭车问，我同时用Qiagen RNA mini kit提WT和mutant动物肠子的RNA，
已经三次了，每次mutant的RNA nanodrop 260:230<0.5 （WT 260:230>2)
这是为什么？难道mutant肠子中有特别的东西？
【在 l******g 的大作中提到】
: 正常，不会影响后续步骤。
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 肠子的RNA Is very low yield. |
l**********1
发帖数: 5204 | 8 next try gentleMACS™ Octo Dissociator
RUN four WT and four Mutant on the same dissociation/RNA extraction
then use Qiagen RNA mini kit
then compare WT and Mutant sample OD value
PDF link:
HTTPS//www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0002000/
IM0002018.ashx
18,600 usd/unit
or small type: gentleMACS™ Dissociator
HTTPS//www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001600/
IM0001677.ashx
5,700 usd/unit
or contact details:
HTTPS//www.miltenyibiotec.com/en/About-us/Contact.aspx
【在 s*******e 的大作中提到】
: 搭车问，我同时用Qiagen RNA mini kit提WT和mutant动物肠子的RNA，
: 已经三次了，每次mutant的RNA nanodrop 260:230<0.5 （WT 260:230>2)
: 这是为什么？难道mutant肠子中有特别的东西？
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s*******e
发帖数: 1389 | 9 哇，你真聪明。一下就看出我dissociate组织有问题。确实mutant tissue和WT tissue
区别挺大的，数量也不一样多，我却全靠手磨，有问题也出在这里了。
你贴的东西真不错。买是不现实，我去找找哪个实验室有这个东西，下次去用一下。
很感谢你提供的信息！
【在 l**********1 的大作中提到】
: next try gentleMACS™ Octo Dissociator
: RUN four WT and four Mutant on the same dissociation/RNA extraction
: then use Qiagen RNA mini kit
: then compare WT and Mutant sample OD value
: PDF link:
: HTTPS//www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0002000/
: IM0002018.ashx
: 18,600 usd/unit
: or small type: gentleMACS™ Dissociator
: HTTPS//www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001600/
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 De rein.
tissue
【在 s*******e 的大作中提到】
: 哇，你真聪明。一下就看出我dissociate组织有问题。确实mutant tissue和WT tissue
: 区别挺大的，数量也不一样多，我却全靠手磨，有问题也出在这里了。
: 你贴的东西真不错。买是不现实，我去找找哪个实验室有这个东西，下次去用一下。
: 很感谢你提供的信息！
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q***7
发帖数: 144 | 11 QIAGEN做为质粒提取的老大，从来没有想过改进。这具体和欧洲人的特性有关吧。你那
测出来的都是洗液(总称solvent)。后面会影响到连接酶的活性,从而影响克隆效率，导
致克隆效率降低。做难连接的大片段时尤其明显。
我现在一直在用这个公司的Kit，便宜(价格是Qiagen的一半)，而且有创新。用他们Kit
（胶和PCR片段合二为一的，非常方便）提取的片段就很纯，连接克隆效率都很高。建
议你用用这个。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-isolation-miniprep- |
q***7
发帖数: 144 | 12 你那测出来的都是洗液(总称solvent)。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样品
的浓度不一样，你做qPCR时，要调成一样的浓度，这样你做反转录的每一个样品的反应
液里含有的洗液浓度就不一样。不一样的洗液浓度，抑制反转录酶的程度也不一样。这
样你最后出来的qPCR结果肯定不准确。有的样品里表达低，可能是因为洗液多而抑制了
反转录酶造成的，而不是真正的表达低。如果你同一组的样品，有的表达高，有的表达
低，一般都是这个原因造成的建议你试一试这个公司的KIT，而且还可以同时检测小RNA
。便宜又好用
http://www.greenbioresearch.com/mitotal-rnamini-using-qiagen-ki
【在 s*******e 的大作中提到】
: 搭车问，我同时用Qiagen RNA mini kit提WT和mutant动物肠子的RNA，
: 已经三次了，每次mutant的RNA nanodrop 260:230<0.5 （WT 260:230>2)
: 这是为什么？难道mutant肠子中有特别的东西？
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o*****a
发帖数: 2335 | 13 230nm的问题据说是RLT buffer没弄干净，网上的经验是RPE洗的时候把柱子来回颠倒几
次，连lid都要洗到，还有除RPE的时候离心两次，第二次离心时把柱子转个方向
【在 s*******e 的大作中提到】
: 搭车问，我同时用Qiagen RNA mini kit提WT和mutant动物肠子的RNA，
: 已经三次了，每次mutant的RNA nanodrop 260:230<0.5 （WT 260:230>2)
: 这是为什么？难道mutant肠子中有特别的东西？
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w**********s
发帖数: 8 | |
b******n
发帖数: 4225 | 15 230的峰主要是多糖类的，agarose make sense
【在 w**********s 的大作中提到】
: that is agarose/sugar
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q***7
发帖数: 144 | 16 你可以配点一定浓度的sugar，测测是不是在那有吸收峰。直接纯化PCR产物也在２３０
那里有个很强的吸收峰，请问那SUGAR是那里来的？agarose怎么在低温下成液体的？
【在 w**********s 的大作中提到】
: that is agarose/sugar
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s******s
发帖数: 13035 | 17 ft, 有QG, agarose当然是液体，否则你加的什么样啊。
【在 q***7 的大作中提到】
: 你可以配点一定浓度的sugar，测测是不是在那有吸收峰。直接纯化PCR产物也在２３０
: 那里有个很强的吸收峰，请问那SUGAR是那里来的？agarose怎么在低温下成液体的？
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m****M
发帖数: 360 | 18 我认为影响260/230比值的是你说的QG buffer，而不是agarose.
大家都在这里猜，还不如去测一下。
你可以用NANODROP测一下QG BUFFER的吸收峰，然后再测一个溶了agarose胶的QG
BUFFER测一下，看看有没有区别你就知道了。
同时你也可以测一下洗液的吸收峰在哪里。
【在 s******s 的大作中提到】
: ft, 有QG, agarose当然是液体，否则你加的什么样啊。
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