m******5
发帖数: 1383 | 1 我怀疑两个蛋白的相互作用只在核成分里发生，细胞质成分会抑制其相互作用，于是计
划用核抽提物做co-ip
发上根据别人文章里方法设计的protocol，请有经验的同僚帮忙看看有没问题？
1, 10 mm 盘NIH 3T3 细胞， 用 500 ul 10mM hepes, 10mM NAcl冰上重悬溶胀
2，半小时后过针头，理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开
3，500G低速离心收核
4，等volumn高盐高甘油buffer吹吸
5，再加等总体积的低盐buffer降盐浓度至140mM， 降NP-40至0.5%
6，常规co-ip步骤
大家说这个protocol会有大问题么？这个相互作用难做，之前曾经有这个protocol做出
过很强的相互作用，但不说明protocol没问题 |
m******5
发帖数: 1383 | |
m******5
发帖数: 1383 | 3 急求啊急求啊…… 给个中肯评价当thanksgiving gift吧…… |
w***a
发帖数: 1053 | 4 建议测测细胞核里没有的maker，看看是不是完全是核提取物。 |
m******5
发帖数: 1383 | 5 恩，一般是用tublin作cytoplasmic marker
从方法上说这样没问题么？另外，核能裂完全么？
【在 w***a 的大作中提到】
: 建议测测细胞核里没有的maker，看看是不是完全是核提取物。
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p******i
发帖数: 1092 | 6 第二步后在显微镜下看到“理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开”了吗？
【在 m******5 的大作中提到】
: 我怀疑两个蛋白的相互作用只在核成分里发生，细胞质成分会抑制其相互作用，于是计
: 划用核抽提物做co-ip
: 发上根据别人文章里方法设计的protocol，请有经验的同僚帮忙看看有没问题？
: 1, 10 mm 盘NIH 3T3 细胞， 用 500 ul 10mM hepes, 10mM NAcl冰上重悬溶胀
: 2，半小时后过针头，理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开
: 3，500G低速离心收核
: 4，等volumn高盐高甘油buffer吹吸
: 5，再加等总体积的低盐buffer降盐浓度至140mM， 降NP-40至0.5%
: 6，常规co-ip步骤
: 大家说这个protocol会有大问题么？这个相互作用难做，之前曾经有这个protocol做出
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m******5
发帖数: 1383 | 7 确实是这样……其实即使是用常规裂解方法在显微镜下看也还是有很多核是完整的
这个相互作用又太脆了我连超声都不敢用……
【在 p******i 的大作中提到】
: 第二步后在显微镜下看到“理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开”了吗？
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s******r
发帖数: 2876 | 8 Protocol看上去没有什么问题，
这么说吧，相互做用强弱也只是相对的，
只要有合适的control，就能说明问题，
Just do it.
【在 m******5 的大作中提到】
: 我怀疑两个蛋白的相互作用只在核成分里发生，细胞质成分会抑制其相互作用，于是计
: 划用核抽提物做co-ip
: 发上根据别人文章里方法设计的protocol，请有经验的同僚帮忙看看有没问题？
: 1, 10 mm 盘NIH 3T3 细胞， 用 500 ul 10mM hepes, 10mM NAcl冰上重悬溶胀
: 2，半小时后过针头，理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开
: 3，500G低速离心收核
: 4，等volumn高盐高甘油buffer吹吸
: 5，再加等总体积的低盐buffer降盐浓度至140mM， 降NP-40至0.5%
: 6，常规co-ip步骤
: 大家说这个protocol会有大问题么？这个相互作用难做，之前曾经有这个protocol做出
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a******g
发帖数: 129 | 9 你的初始细胞量太少，最后只会拿到一点点和抽提物，
更具我的经验，你至少要5-6盘抽nuclear extract.
另外，小规模的ne extraction我推荐用0.1% triton x-100代替
针头破核，会减少很多损失
【在 m******5 的大作中提到】
: 我怀疑两个蛋白的相互作用只在核成分里发生，细胞质成分会抑制其相互作用，于是计
: 划用核抽提物做co-ip
: 发上根据别人文章里方法设计的protocol，请有经验的同僚帮忙看看有没问题？
: 1, 10 mm 盘NIH 3T3 细胞， 用 500 ul 10mM hepes, 10mM NAcl冰上重悬溶胀
: 2，半小时后过针头，理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开
: 3，500G低速离心收核
: 4，等volumn高盐高甘油buffer吹吸
: 5，再加等总体积的低盐buffer降盐浓度至140mM， 降NP-40至0.5%
: 6，常规co-ip步骤
: 大家说这个protocol会有大问题么？这个相互作用难做，之前曾经有这个protocol做出
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m******5
发帖数: 1383 | 10 恩，主要是这个相互作用才刚开始做，还没有很合适的negative control
非常感谢！
【在 s******r 的大作中提到】
: Protocol看上去没有什么问题，
: 这么说吧，相互做用强弱也只是相对的，
: 只要有合适的control，就能说明问题，
: Just do it.
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m******5
发帖数: 1383 | 11 谢谢！
【在 a******g 的大作中提到】
: 你的初始细胞量太少，最后只会拿到一点点和抽提物，
: 更具我的经验，你至少要5-6盘抽nuclear extract.
: 另外，小规模的ne extraction我推荐用0.1% triton x-100代替
: 针头破核，会减少很多损失
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m******5
发帖数: 1383 | 12 是建议用针头破核还是不建议？看糊涂了
另外有一个流行的说法是triton X-100会洗掉很多弱相互作用。 另外可能会打散
chromosome制造一些问题
【在 a******g 的大作中提到】
: 你的初始细胞量太少，最后只会拿到一点点和抽提物，
: 更具我的经验，你至少要5-6盘抽nuclear extract.
: 另外，小规模的ne extraction我推荐用0.1% triton x-100代替
: 针头破核，会减少很多损失
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g*********5
发帖数: 2533 | |
