k****a
发帖数: 83 | 1 大家好。我是新手，老板让我一个人完成一个小课题，就是看A蛋白和B蛋白的作用位点
。已经证实了A蛋白和B蛋白能够Bind,但是接下来就是让我证明B蛋白是bind在A蛋白的
哪个部分。
现在老板让我纯化蛋白，然后再让我做这个证明。因为我以前没有做过这方面的东西，
所以有点晕。我查看了文献，发现用Immunoprecipitation是可以证明A蛋白和B蛋白是
否bind的。
现在，我想如果在A蛋白上做过mutation，是其某一部分失活，而另一部分正常，我想
应该也可以证明B蛋白结合到A蛋白哪个部分的问题吧。或者是用放射性物质标记B蛋白
，然后两者结合后再看放射性物质是在A蛋白的哪个部分。
我的问题是，我发现文献上的immunoprecipitation都是细胞里面做的。但是现在我老
板让我纯化蛋白，我想问一下，纯化后的蛋白怎么做这个protein protein
interaction.
问题很幼稚。先谢谢大家。 |
p****s
发帖数: 3153 | 2 纯做突变不能证明是在突变位置结合，因为可能会有allosteric effect
同位素标记更不可能了，因为根本没那个解析度...
你的蛋白大么，如果不大可以考虑做NMR，要不可以考虑做EPR，或者FRET
【在 k****a 的大作中提到】
: 大家好。我是新手，老板让我一个人完成一个小课题，就是看A蛋白和B蛋白的作用位点
: 。已经证实了A蛋白和B蛋白能够Bind,但是接下来就是让我证明B蛋白是bind在A蛋白的
: 哪个部分。
: 现在老板让我纯化蛋白，然后再让我做这个证明。因为我以前没有做过这方面的东西，
: 所以有点晕。我查看了文献，发现用Immunoprecipitation是可以证明A蛋白和B蛋白是
: 否bind的。
: 现在，我想如果在A蛋白上做过mutation，是其某一部分失活，而另一部分正常，我想
: 应该也可以证明B蛋白结合到A蛋白哪个部分的问题吧。或者是用放射性物质标记B蛋白
: ，然后两者结合后再看放射性物质是在A蛋白的哪个部分。
: 我的问题是，我发现文献上的immunoprecipitation都是细胞里面做的。但是现在我老
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k****a
发帖数: 83 | 3
谢谢了。我的B蛋白是38KD。A蛋白大约是50KD。应该不算大吧。
不好意思，NMR，EPR是什么？我知道FRET。
【在 p****s 的大作中提到】
: 纯做突变不能证明是在突变位置结合，因为可能会有allosteric effect
: 同位素标记更不可能了，因为根本没那个解析度...
: 你的蛋白大么，如果不大可以考虑做NMR，要不可以考虑做EPR，或者FRET
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p****s
发帖数: 3153 | 4 NMR: nuclear magnetic resonance
EPR: electron paramagnetic(spin) resonance
看来你的体系做EPR或者FRET比较合适，别的方法我不太熟悉。突变只能间接证明，不
是直接证据
【在 k****a 的大作中提到】
:
: 谢谢了。我的B蛋白是38KD。A蛋白大约是50KD。应该不算大吧。
: 不好意思，NMR，EPR是什么？我知道FRET。
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K******S
发帖数: 10109 | 5 D/H exchange using mass spec
【在 k****a 的大作中提到】
: 大家好。我是新手，老板让我一个人完成一个小课题，就是看A蛋白和B蛋白的作用位点
: 。已经证实了A蛋白和B蛋白能够Bind,但是接下来就是让我证明B蛋白是bind在A蛋白的
: 哪个部分。
: 现在老板让我纯化蛋白，然后再让我做这个证明。因为我以前没有做过这方面的东西，
: 所以有点晕。我查看了文献，发现用Immunoprecipitation是可以证明A蛋白和B蛋白是
: 否bind的。
: 现在，我想如果在A蛋白上做过mutation，是其某一部分失活，而另一部分正常，我想
: 应该也可以证明B蛋白结合到A蛋白哪个部分的问题吧。或者是用放射性物质标记B蛋白
: ，然后两者结合后再看放射性物质是在A蛋白的哪个部分。
: 我的问题是，我发现文献上的immunoprecipitation都是细胞里面做的。但是现在我老
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 这个是小课题，那你老板的大课题是什么啊？。。。
如果是两个未知结构的蛋白，这个够做一博士论文了。。。
NMR是核磁共振，EPR是电磁共振，都是解析结构的手段。你的蛋白size不大也不小了，
说不定要用X-ray crystallography。 |
e****s
发帖数: 1125 | 7 要证明相互作用的话，用Pure protein做directly pull-down就可以了。在一个蛋白上
弄个His或
者GST tag。但这个和IP一样受限于binding affinity。
荧光和EPR是很好的选择，但这两个方法的缺点就是要标记荧光基团或者是Spin-label
基团。通常
最安全的是Cys标记，这样你最好要有Cys-less蛋白。当然你也可以用GFP之类的做。
FRET和EPR最
大的优点还有一个就是可以Mapping binding sites。
ITC, Light scatter, Surface plasmon resonance也可以，都不需要标记蛋白。
说实话，找Binding site有时候会很简单，有时候会很让人沮丧的。
【在 k****a 的大作中提到】
:
: 谢谢了。我的B蛋白是38KD。A蛋白大约是50KD。应该不算大吧。
: 不好意思，NMR，EPR是什么？我知道FRET。
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k****a
发帖数: 83 | 8 谢谢以上各位。
我们的蛋白都是已知结构的，但是发现两者能够结合还是第一次。
纯化的蛋白怎么直接pull down呢？我只在cell里做过。
后来跟老板谈了一下，他让我用突变的方法。看来他也是没有考虑到allosteric
effect。
我得学习一下FRET，因为我就是要知道B蛋白在A蛋白上的binding sites。
再一次感谢！ |
p****s
发帖数: 3153 | 9 pull down只能证明结合吧，不能证明在哪儿结合，不过我不懂这个
如果你的蛋白没有cysteine，可以考虑做EPR，FRET也不错，因为似乎有天然的荧光集
团，不过我不
太懂
楼下有位说做H/D exchange -MS 也是个好方法，而且不需要modification
【在 k****a 的大作中提到】
: 谢谢以上各位。
: 我们的蛋白都是已知结构的，但是发现两者能够结合还是第一次。
: 纯化的蛋白怎么直接pull down呢？我只在cell里做过。
: 后来跟老板谈了一下，他让我用突变的方法。看来他也是没有考虑到allosteric
: effect。
: 我得学习一下FRET，因为我就是要知道B蛋白在A蛋白上的binding sites。
: 再一次感谢！
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 别的我不熟。
不过ITC需要的蛋白用量相当大，如果蛋白纯化比较麻烦的话，还是先考虑其他方法比
较好。
而且ITC，SPR这些也只能证明有binding，没办法mapping binding site的吧。除非加
上site-directed mutations，但是那样又回到allosteric effect的老问题上来了。
label
【在 e****s 的大作中提到】
: 要证明相互作用的话，用Pure protein做directly pull-down就可以了。在一个蛋白上
: 弄个His或
: 者GST tag。但这个和IP一样受限于binding affinity。
: 荧光和EPR是很好的选择，但这两个方法的缺点就是要标记荧光基团或者是Spin-label
: 基团。通常
: 最安全的是Cys标记，这样你最好要有Cys-less蛋白。当然你也可以用GFP之类的做。
: FRET和EPR最
: 大的优点还有一个就是可以Mapping binding sites。
: ITC, Light scatter, Surface plasmon resonance也可以，都不需要标记蛋白。
: 说实话，找Binding site有时候会很简单，有时候会很让人沮丧的。
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k****a
发帖数: 83 | 11 謝謝各位。但是我查了一下，發現别构效应是针对酶的吧。 |
p****s
发帖数: 3153 | 12 这词是从酶学那里来的，但是我想大家在这里所说的意思是长程的对蛋白结构的影响。
这个应该是不能
忽略的吧
【在 k****a 的大作中提到】
: 謝謝各位。但是我查了一下，發現别构效应是针对酶的吧。
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e****s
发帖数: 1125 | 13 说实话，我不大明白你这里强调allosteric regulation 对通过突变来寻找binding
sites的影
响，特别是楼主做的是两个蛋白间的作用。愿闻其详。
能想到的最复杂的情况就是有多个结合点，结合点间存在Allosteric effects。就是这
样，只要
有一个灵敏可靠的binding assay，只要有效的降低结合，应该也能检测出来。
【在 p****s 的大作中提到】
: 这词是从酶学那里来的，但是我想大家在这里所说的意思是长程的对蛋白结构的影响。
: 这个应该是不能
: 忽略的吧
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m**z
发帖数: 787 | 14 不一定是多个结合为点之间的allosteric effect.如果蛋白通过A点与另一个蛋白
binding,在一个不相关的B点的突变，可能影响A点的conformation/structure/
dynamics,从而影响与另一个蛋白的binding.B点可能与A点在蛋白结构中相距甚远，这
个effect就是allotery把
【在 e****s 的大作中提到】
: 说实话，我不大明白你这里强调allosteric regulation 对通过突变来寻找binding
: sites的影
: 响，特别是楼主做的是两个蛋白间的作用。愿闻其详。
: 能想到的最复杂的情况就是有多个结合点，结合点间存在Allosteric effects。就是这
: 样，只要
: 有一个灵敏可靠的binding assay，只要有效的降低结合，应该也能检测出来。
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D***a
发帖数: 516 | 15 以前的文章里面不都是一段一段的做deletion，然后做IP吗？难道过时了？ |
e****s
发帖数: 1125 | 16 你这里说的和我理解的allosteric effect有点点不一样，我对这些确实不大了解，可
能理解有偏
差。 我理解的是第3者的远程的结合引起一个蛋白构象的改变，从而影响和另一个蛋白
或者底物的结
合。另外一点，LZ可以看一下你的蛋白是单聚体还是多聚体。通常认为oligomers 相对有
allosteric effect的机率更大。
你说的这个现象肯定存在，但更像是misfolding带来的？所以不管怎么突变，一定要检
测该蛋白的主
要活性有否明显的变化，酶起码测酶活，蛋白起码检测主要功能,CD之类的也行。标记
前后也得比较活
性。
话也说回来，有一天心血来潮想了个Idea，想做两个蛋白间的结合，结果发现以前发表
的结合位点完全
错误。于是就来兴趣想确定这两个蛋白的相互结合位点，结果1年半了，还没有Promising的
结果。估计那
个大牛组里的也是逼急了，编了个故事出来。当然走了不少弯路，组里也没人做这个的。
【在 m**z 的大作中提到】
: 不一定是多个结合为点之间的allosteric effect.如果蛋白通过A点与另一个蛋白
: binding,在一个不相关的B点的突变，可能影响A点的conformation/structure/
: dynamics,从而影响与另一个蛋白的binding.B点可能与A点在蛋白结构中相距甚远，这
: 个effect就是allotery把
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t**m
发帖数: 158 | 17 都有结构了就找做计算的人做docking啊,
算他十几对可能的interface, 然后挨个突变掉看interaction
上面各位说的都是检测interaction的方法, 没办法找interface
再不然看看这两个蛋白的complex稳定不, 稳定的话找做结构的解complex结构去
当然这样credit就是人家的了
【在 k****a 的大作中提到】
: 谢谢以上各位。
: 我们的蛋白都是已知结构的，但是发现两者能够结合还是第一次。
: 纯化的蛋白怎么直接pull down呢？我只在cell里做过。
: 后来跟老板谈了一下，他让我用突变的方法。看来他也是没有考虑到allosteric
: effect。
: 我得学习一下FRET，因为我就是要知道B蛋白在A蛋白上的binding sites。
: 再一次感谢！
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g***y
发帖数: 33 | 18 有两种办法，一种是pull down:这个必须要其中有一个protein有一个tag，让它先bind
with beads first,类似整个过程类似于protein purification,最后用WB鉴定；第二
种方法是用protein microarray,先imobilize 一个protein 到slides上面，然后荧光
标记另外一个蛋白，incubation,wash,detect. |
H****S
发帖数: 40 | 19 如果可以纯化出浓度在mg/ml级别的蛋白，你可以尝试做SPR, ITC来验证。其中ITC是很
成熟的技术，文献里应该会有很多；SPR也有较广的运用，但是在固定其中一个蛋白的
时候，比较tricky。好处是，这两种技术都是quantitative的，而且是label-free，外
来的tag(如GFP)对测binding affinity影响比较小。 |
y****m
发帖数: 37 | 20 reverse yeast two hybrid
【在 k****a 的大作中提到】
: 大家好。我是新手，老板让我一个人完成一个小课题，就是看A蛋白和B蛋白的作用位点
: 。已经证实了A蛋白和B蛋白能够Bind,但是接下来就是让我证明B蛋白是bind在A蛋白的
: 哪个部分。
: 现在老板让我纯化蛋白，然后再让我做这个证明。因为我以前没有做过这方面的东西，
: 所以有点晕。我查看了文献，发现用Immunoprecipitation是可以证明A蛋白和B蛋白是
: 否bind的。
: 现在，我想如果在A蛋白上做过mutation，是其某一部分失活，而另一部分正常，我想
: 应该也可以证明B蛋白结合到A蛋白哪个部分的问题吧。或者是用放射性物质标记B蛋白
: ，然后两者结合后再看放射性物质是在A蛋白的哪个部分。
: 我的问题是，我发现文献上的immunoprecipitation都是细胞里面做的。但是现在我老
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H*g
发帖数: 2333 | 21 I feel, before you dedicate too much time on those biochemical protein-
protein assay, it may be better to test if the observed in vitro interaction
is biological meaningful. |
s****l
发帖数: 395 | 22 蛋白如果容易从E.coli纯化的话, 用15N label protein，NMR看HSQC谱的变化能知道结
合区域
【在 k****a 的大作中提到】
: 大家好。我是新手，老板让我一个人完成一个小课题，就是看A蛋白和B蛋白的作用位点
: 。已经证实了A蛋白和B蛋白能够Bind,但是接下来就是让我证明B蛋白是bind在A蛋白的
: 哪个部分。
: 现在老板让我纯化蛋白，然后再让我做这个证明。因为我以前没有做过这方面的东西，
: 所以有点晕。我查看了文献，发现用Immunoprecipitation是可以证明A蛋白和B蛋白是
: 否bind的。
: 现在，我想如果在A蛋白上做过mutation，是其某一部分失活，而另一部分正常，我想
: 应该也可以证明B蛋白结合到A蛋白哪个部分的问题吧。或者是用放射性物质标记B蛋白
: ，然后两者结合后再看放射性物质是在A蛋白的哪个部分。
: 我的问题是，我发现文献上的immunoprecipitation都是细胞里面做的。但是现在我老
|
w********r
发帖数: 1431 | 23 无语了，好多人真是擅长把简单的问题复杂化来显示自己的渊博...
你们最早是用什么Assay发现AB结合的？
那你就继续用这个Assay(不管是co-ip还是pull down还是NMR还是荧光啥高科技)，
根据已知的AB的结构做各种truncation/deletion（避免蛋白misfolding）,
继续用你的Assay检测，就知道那个部分是负责结合的了
【在 k****a 的大作中提到】
: 大家好。我是新手，老板让我一个人完成一个小课题，就是看A蛋白和B蛋白的作用位点
: 。已经证实了A蛋白和B蛋白能够Bind,但是接下来就是让我证明B蛋白是bind在A蛋白的
: 哪个部分。
: 现在老板让我纯化蛋白，然后再让我做这个证明。因为我以前没有做过这方面的东西，
: 所以有点晕。我查看了文献，发现用Immunoprecipitation是可以证明A蛋白和B蛋白是
: 否bind的。
: 现在，我想如果在A蛋白上做过mutation，是其某一部分失活，而另一部分正常，我想
: 应该也可以证明B蛋白结合到A蛋白哪个部分的问题吧。或者是用放射性物质标记B蛋白
: ，然后两者结合后再看放射性物质是在A蛋白的哪个部分。
: 我的问题是，我发现文献上的immunoprecipitation都是细胞里面做的。但是现在我老
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