n**********s
发帖数: 228 | 1 刚engineer了一个bluescrppit 的质粒，大约17k，用Qiagen的常规大抽试剂盒，就是
过柱子那种，结果试了几次yield都很低，只有三十来微克，不知道原因是啥，同样的
试剂盒抽14k的质粒还好好的，
变懒了，上来问问大家这种stupid的问题，怎么能提高yield？换试剂盒还是自己配试
剂抽提？ |
n***w
发帖数: 2405 | |
n**********s
发帖数: 228 | |
n***w
发帖数: 2405 | 4 我没有做过大提，我原来有次做miniprep发现产量低是因为我的wash buffer没有加
EtOH. |
j*****a
发帖数: 658 | 5 17k的这个你小提过吗？确定bacteria里扩增没问题？有时候太大somehow bacteria不
扩增。我的
意思是可能就没产生很多智力。
【在 n**********s 的大作中提到】
: 刚engineer了一个bluescrppit 的质粒，大约17k，用Qiagen的常规大抽试剂盒，就是
: 过柱子那种，结果试了几次yield都很低，只有三十来微克，不知道原因是啥，同样的
: 试剂盒抽14k的质粒还好好的，
: 变懒了，上来问问大家这种stupid的问题，怎么能提高yield？换试剂盒还是自己配试
: 剂抽提？
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Z****o
发帖数: 999 | 6 换E.coli菌株吧，记得有一种菌株专门适合表达大的质粒，比如BAC，YAC库之类的。一
般的E.coli菌株表达12k以上的质粒都比较吃力。 |
n**********s
发帖数: 228 | 7 不好意思是没详细说，
是连接克隆，转化用的XL-10 gold，扩增没有什么问题，小抽都能抽到质粒，鉴定也正
确。
唯一不同的是，小抽的时候没用Qiagen的miniprep柱子，因为抽不出来，我都是用的S1
TO S3 buffer加乙醇沉淀提出来的，10k以上的质粒我基本上用后者
现在想既然扩增没问题，是不是同样的方法大抽也可行？不过柱子是不是杂质很多？以
前听人说，很久前大家用什么纱布之类的用于大抽时过滤用？
【在 j*****a 的大作中提到】
: 17k的这个你小提过吗？确定bacteria里扩增没问题？有时候太大somehow bacteria不
: 扩增。我的
: 意思是可能就没产生很多智力。
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h******y
发帖数: 1374 | 8 Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Filter Midi⁄Maxi Kit |
n*****e
发帖数: 119 | 9 我的质粒23kb，qiagen小提大提都没有问题。但是xl-10gold细胞在我这不行，我用的
是stratagene的sure cell。
S1
【在 n**********s 的大作中提到】
: 不好意思是没详细说，
: 是连接克隆，转化用的XL-10 gold，扩增没有什么问题，小抽都能抽到质粒，鉴定也正
: 确。
: 唯一不同的是，小抽的时候没用Qiagen的miniprep柱子，因为抽不出来，我都是用的S1
: TO S3 buffer加乙醇沉淀提出来的，10k以上的质粒我基本上用后者
: 现在想既然扩增没问题，是不是同样的方法大抽也可行？不过柱子是不是杂质很多？以
: 前听人说，很久前大家用什么纱布之类的用于大抽时过滤用？
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S*****s
发帖数: 287 | 10 最后洗脱的 buffer 你预热没？我做 BAC 的时候和他们的 Tech 谈过，据说这个柱子
提 BAC 都没问题，就是要把溶液一二三的量加倍，然后 elution buffer 加热到 65
度。
【在 n**********s 的大作中提到】
: 刚engineer了一个bluescrppit 的质粒，大约17k，用Qiagen的常规大抽试剂盒，就是
: 过柱子那种，结果试了几次yield都很低，只有三十来微克，不知道原因是啥，同样的
: 试剂盒抽14k的质粒还好好的，
: 变懒了，上来问问大家这种stupid的问题，怎么能提高yield？换试剂盒还是自己配试
: 剂抽提？
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s******s
发帖数: 13035 | 11 //nod,nod, 我也被专业人士教过要预热elution buffer
【在 S*****s 的大作中提到】
: 最后洗脱的 buffer 你预热没？我做 BAC 的时候和他们的 Tech 谈过，据说这个柱子
: 提 BAC 都没问题，就是要把溶液一二三的量加倍，然后 elution buffer 加热到 65
: 度。
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a****d
发帖数: 1919 | 12 My experience:
heating up the elution buffer;
after mixing the eluted product with isopropanol,store at -20 for couple
hours,or overnight,then centrifuge. |
