s******y
发帖数: 28562 | 1 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
有人有经验么？
求指点。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 2 木有经验。。。
只用Urea Gel跑过核酸，记得好像都不加acetic acid的，就是用的TBE，TBE是偏碱性
的，所以应该用碱性buffer也没啥问题吧。
这个文献不知道有没有帮助：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7536962
我没去下来看，所以不知道细节。 |
s******y
发帖数: 28562 | 3 谢谢！这个文章很有用，至少它告诉了我这个胶该怎么配。
不知道有没有人用过这个技术。我现在担心的就是不知道我的蛋白该跑多久，
比方说怎么估计这个跑胶的时间。因为这个似乎就和loading dye 没有关系了。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 木有经验。。。
: 只用Urea Gel跑过核酸，记得好像都不加acetic acid的，就是用的TBE，TBE是偏碱性
: 的，所以应该用碱性buffer也没啥问题吧。
: 这个文献不知道有没有帮助：
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7536962
: 我没去下来看，所以不知道细节。
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 为什么一定要用urea PAGE呢？普通的SDS-PAGE不行么？
我没跑过urea page的蛋白胶，不知道这个方法的好处在哪里，还请指教。 |
s******y
发帖数: 28562 | 5 普通的胶有些事情做不了
urea 胶可以由于电性的不同来区分不同的蛋白修饰，比方说如果是磷酸化的话
就会跑得和主带不一样了。
这个其实是比较传统的实验。现在有了质谱这个这个实验都快失传了。
但是质谱的坏处是很难定量，而且也不是那么的consistant， 看到了就说有，
没看到则不能说有没有，
【在 T**********t 的大作中提到】
: 为什么一定要用urea PAGE呢？普通的SDS-PAGE不行么？
: 我没跑过urea page的蛋白胶，不知道这个方法的好处在哪里，还请指教。
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 哦，又学习了。：）
【在 s******y 的大作中提到】
: 普通的胶有些事情做不了
: urea 胶可以由于电性的不同来区分不同的蛋白修饰，比方说如果是磷酸化的话
: 就会跑得和主带不一样了。
: 这个其实是比较传统的实验。现在有了质谱这个这个实验都快失传了。
: 但是质谱的坏处是很难定量，而且也不是那么的consistant， 看到了就说有，
: 没看到则不能说有没有，
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s******s
发帖数: 13035 | 7 去查一下histone的文章或者lab, 这个应该都是你说的那种
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
: 所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
: 但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
: 有人有经验么？
: 求指点。
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s******y
发帖数: 28562 | 8 Histone 是碱性蛋白，所以可以用比较常用的acetic acid-urea PAGE.
我们的蛋白是酸性的，不能用他们的配方。
【在 s******s 的大作中提到】
: 去查一下histone的文章或者lab, 这个应该都是你说的那种
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 你跑变性胶为什么还需要顾忌pH值？
好奇这个酸性urea PAGE是做什么用的？
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
: 所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
: 但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
: 有人有经验么？
: 求指点。
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s******y
发帖数: 28562 | 10 酸性urea 胶用来跑碱性蛋白是为了分析posttranslational modification
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你跑变性胶为什么还需要顾忌pH值？
: 好奇这个酸性urea PAGE是做什么用的？
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 学习了
谢谢
一直做原核的蛋白
对于posttranslational modification不熟：）
借问一下
如果一个蛋白怀疑有糖基化修饰
第一步该怎么验证呢？
【在 s******y 的大作中提到】
: 酸性urea 胶用来跑碱性蛋白是为了分析posttranslational modification
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s******y
发帖数: 28562 | 12
糖基化的蛋白跑在一般的SDS-PAGE 里会成一条长长的拖带。
然后用糖水解酶处理之后拖带会消失。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 学习了
: 谢谢
: 一直做原核的蛋白
: 对于posttranslational modification不熟：）
: 借问一下
: 如果一个蛋白怀疑有糖基化修饰
: 第一步该怎么验证呢？
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A******d
发帖数: 571 | 13 why not do a 2-D gel? phosphorylation will be very easy to see
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
: 所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
: 但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
: 有人有经验么？
: 求指点。
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s******y
发帖数: 28562 | 14 自己没有仪器跑2D。
送到core 太贵（150多美元跑一次，而且跑坏了不管），而且还慢
（至少得一个星期才能给结果，最慢的时候要等一个月，因为人家忙得很。
另外一个考量就是2D每跑一个胶要比较大的上样量，还有不同的样品比较起来
很麻烦。
Urea胶需要的上样量小，而且很容易side by side 跑几条lane,
各种条件处理的结果一目了然。
【在 A******d 的大作中提到】
: why not do a 2-D gel? phosphorylation will be very easy to see
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c*c
发帖数: 2397 | 15 分子克隆上就有啊，跑单链核酸用。配方应该在单链探针制备那部分。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
: 所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
: 但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
: 有人有经验么？
: 求指点。
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s******y
发帖数: 28562 | 16 谢谢，但是那个不是给蛋白设计的，没有stacking gel,
跑出来的带会特别胖
【在 c*c 的大作中提到】
: 分子克隆上就有啊，跑单链核酸用。配方应该在单链探针制备那部分。
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i*****g
发帖数: 11893 | 17 urea hydrolyzed in basic PH
typical SDS-PAGE may or may not work out this phos-acid protein modification
years ago i learned the multiple-phos of ATR protein generates a smear of up
-bands in the gel. |
c******y
发帖数: 148 | 18 自己灌IEF胶，然后直接把一相转膜western
不过抗体检测，一般都有很多修饰点的 |
i******k
发帖数: 4625 | 19 读研究生时隔壁实验室经常跑尿素胶看叶绿体膜蛋白
手头正好有《蛋白质技术手册》
见附件，应该很简单的
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
: 所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
: 但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
: 有人有经验么？
: 求指点。
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X******n
发帖数: 914 | 20 If you want to see phosphorylation, you could try either Mn2+–Phos-tag SDS-
PAGE gel or treat your protein with NTCB.
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们只有acetic acid urea PAGE 的配方，但是现在要跑一个酸性蛋白
: 所以不能用acetic acid urea PAGE。 我觉得应该也有碱性urea PAGE吧？
: 但是很少听说过。不知道这种配方是否存在？
: 有人有经验么？
: 求指点。
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s******y
发帖数: 28562 | 21 非常感谢，但是你这个是为了彻底把蛋白变性好跑SDS_PAGE的，
本质上的配方还是SDS_PAGE，蛋白跑起来的速度还是与分子量相关而和本身
电性关系不大。
我需要的是不含SDS 的urea 胶，主要靠电量/分子量的比例来分离蛋白的。
【在 i******k 的大作中提到】
: 读研究生时隔壁实验室经常跑尿素胶看叶绿体膜蛋白
: 手头正好有《蛋白质技术手册》
: 见附件，应该很简单的
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s******y
发帖数: 28562 | 22 谢谢！ 你贴的这个方法很有用。
不过，我能不能问一下什么是NTCB？
SDS-
【在 X******n 的大作中提到】
: If you want to see phosphorylation, you could try either Mn2+–Phos-tag SDS-
: PAGE gel or treat your protein with NTCB.
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X******n
发帖数: 914 | |
s******y
发帖数: 28562 | |
i******k
发帖数: 4625 | 25 不客气，是我看帖不仔细 :-)
我以前酸性碱性的非变性胶都跑过，碱性的就是通常的laemmli系统不加SDS
不知道你这个urea胶是不是使分辨率更好？
我的印象中urea的本质作用是破坏氢键...
【在 s******y 的大作中提到】
: 非常感谢，但是你这个是为了彻底把蛋白变性好跑SDS_PAGE的，
: 本质上的配方还是SDS_PAGE，蛋白跑起来的速度还是与分子量相关而和本身
: 电性关系不大。
: 我需要的是不含SDS 的urea 胶，主要靠电量/分子量的比例来分离蛋白的。
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s******y
发帖数: 28562 | 26 对，是破坏氢键，使得蛋白完全展开，这样蛋白上的修饰（比方说磷酸化和
乙酰化什么的）才能在跑胶的时候体现出差异来。
这个是一个很旧的技术了，好久没有人用了，所以我们一下子找不到protocol,
前面有个同学贴了一个Toxocon 杂志里面的貌似是可用的。就是我不知道有没有
人跑过。
我想请问你一下的是对于一个以前没有跑过的蛋白，怎么大概的根据它的PI value
和分子量估算它在一个胶里要跑多久？跑的时候怎么检查？
我以前用类似的东西跑oligo 的时候可以用紫外检查看看带跑到哪里了，
不知道跑蛋白的时候能不能也来这手？
【在 i******k 的大作中提到】
: 不客气，是我看帖不仔细 :-)
: 我以前酸性碱性的非变性胶都跑过，碱性的就是通常的laemmli系统不加SDS
: 不知道你这个urea胶是不是使分辨率更好？
: 我的印象中urea的本质作用是破坏氢键...
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T**********t
发帖数: 1604 | 27 应该可以吧，蛋白也有紫外吸收的。你把胶放在荧光硅胶板上，用紫外灯照一下，有蛋
白的地方应该就是暗的条带。我只这么看过核酸的胶，但是道理上应该是相通的。不放
心的话，你可以拿块普通的SDS-PAGE胶先照照看。
【在 s******y 的大作中提到】
: 对，是破坏氢键，使得蛋白完全展开，这样蛋白上的修饰（比方说磷酸化和
: 乙酰化什么的）才能在跑胶的时候体现出差异来。
: 这个是一个很旧的技术了，好久没有人用了，所以我们一下子找不到protocol,
: 前面有个同学贴了一个Toxocon 杂志里面的貌似是可用的。就是我不知道有没有
: 人跑过。
: 我想请问你一下的是对于一个以前没有跑过的蛋白，怎么大概的根据它的PI value
: 和分子量估算它在一个胶里要跑多久？跑的时候怎么检查？
: 我以前用类似的东西跑oligo 的时候可以用紫外检查看看带跑到哪里了，
: 不知道跑蛋白的时候能不能也来这手？
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i******k
发帖数: 4625 | 28 这个我还真没有想过。。。
你的sample是purified protein还是lysate之类protein mixture?
如果不是那么宝贵的话，干脆先跑一次看看，之后心里就有底了
【在 s******y 的大作中提到】
: 对，是破坏氢键，使得蛋白完全展开，这样蛋白上的修饰（比方说磷酸化和
: 乙酰化什么的）才能在跑胶的时候体现出差异来。
: 这个是一个很旧的技术了，好久没有人用了，所以我们一下子找不到protocol,
: 前面有个同学贴了一个Toxocon 杂志里面的貌似是可用的。就是我不知道有没有
: 人跑过。
: 我想请问你一下的是对于一个以前没有跑过的蛋白，怎么大概的根据它的PI value
: 和分子量估算它在一个胶里要跑多久？跑的时候怎么检查？
: 我以前用类似的东西跑oligo 的时候可以用紫外检查看看带跑到哪里了，
: 不知道跑蛋白的时候能不能也来这手？
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s******y
发帖数: 28562 | 29 真正的样品还挺宝贵的。现在是打算先拿一个比较不宝贵的样品先跑跑看
这个胶给不给力
【在 i******k 的大作中提到】
: 这个我还真没有想过。。。
: 你的sample是purified protein还是lysate之类protein mixture?
: 如果不是那么宝贵的话，干脆先跑一次看看，之后心里就有底了
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B*****e
发帖数: 1005 | 30 我知道TAU胶很不给力啊，不过经常用在酸蛋白上。发的文章图都很牛X，实际不太好。
【在 s******y 的大作中提到】
: 真正的样品还挺宝贵的。现在是打算先拿一个比较不宝贵的样品先跑跑看
: 这个胶给不给力
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t******u
发帖数: 187 | 31 Native Gel can also be used, like the following paper
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18056630 |
s******y
发帖数: 28562 | 32 什么是TAU胶？Tris acetate Urea ？
能给个连接或者配方么？ 实际应用上有什么问题？
【在 B*****e 的大作中提到】
: 我知道TAU胶很不给力啊，不过经常用在酸蛋白上。发的文章图都很牛X，实际不太好。
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s******y
发帖数: 28562 | 33 Native PAGE 跑出来的东西有点看运气。因为和蛋白的构型和聚合状态有关。
磷酸化的带不一定就是高带或者低带，urea PAGE 在原则上来说分析率应该
很高的，电性有什么风吹草动应该都能看出来。
不过，还是谢谢你贴的文章。
【在 t******u 的大作中提到】
: Native Gel can also be used, like the following paper
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18056630
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B*****e
发帖数: 1005 | 34 就是Tris acetate Urea 啊，我记得nature protocol上有这篇，好象是allis实验室出
来的，手边没这个文章。几年前做过一段时间，实际分辩效果不太好，且重复性也有些
问题。而且这个胶run起来特别麻烦，需要几天的时间。
【在 s******y 的大作中提到】
: 什么是TAU胶？Tris acetate Urea ？
: 能给个连接或者配方么？ 实际应用上有什么问题？
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s******y
发帖数: 28562 | 35 谢谢！我去查一下。如果她们的protocol 里面没有放stacking gel 的话
分辨率的确是不会太好，因为每个band都是一个个的方块.
的确是跑起来需要至少24小时。有时候更长。我想问的是当时你怎么估算
跑的时间的？因为这个好像不能看dye为准所以现在心里特别没数。
【在 B*****e 的大作中提到】
: 就是Tris acetate Urea 啊，我记得nature protocol上有这篇，好象是allis实验室出
: 来的，手边没这个文章。几年前做过一段时间，实际分辩效果不太好，且重复性也有些
: 问题。而且这个胶run起来特别麻烦，需要几天的时间。
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p****p
发帖数: 3360 | 36 啊。找到老师了！
我有一个蛋白8.5左右的pI。用了invitrogen的3-10IEF胶，然后用0.7% 醋酸浸泡并转
膜做western，一直不成功。
你是怎么自己灌胶和转膜的呢？如果能看看你的protocol就太感谢了。
【在 c******y 的大作中提到】
: 自己灌IEF胶，然后直接把一相转膜western
: 不过抗体检测，一般都有很多修饰点的
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p****p
发帖数: 3360 | 37 跑胶需要那么长时间的话，应该可以降低胶的浓度吧。
用普通Native PAGE加urea有什么问题么？核酸电泳用不用urea的PAGE都是一个配方。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！我去查一下。如果她们的protocol 里面没有放stacking gel 的话
: 分辨率的确是不会太好，因为每个band都是一个个的方块.
: 的确是跑起来需要至少24小时。有时候更长。我想问的是当时你怎么估算
: 跑的时间的？因为这个好像不能看dye为准所以现在心里特别没数。
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B*****e
发帖数: 1005 | 38 刚开始的时候就是低压overnight,以dye跑不了胶为基准，第二天来再跑，这样就可以
算到时间了。如果你跑的是biorad的mini胶的话，好象十多个小时就可以了，但前面的
预跑很麻烦。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！我去查一下。如果她们的protocol 里面没有放stacking gel 的话
: 分辨率的确是不会太好，因为每个band都是一个个的方块.
: 的确是跑起来需要至少24小时。有时候更长。我想问的是当时你怎么估算
: 跑的时间的？因为这个好像不能看dye为准所以现在心里特别没数。
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s******y
发帖数: 28562 | 39 pre-run会有什么麻烦？
在这种情况下你一般预跑多久？
你说的以dye跑不了胶为基准是不是指以dye不会动为基准？还是说dye跑不出胶
的末端为基准？
我对这个没有什么经验，请指教：）
【在 B*****e 的大作中提到】
: 刚开始的时候就是低压overnight,以dye跑不了胶为基准，第二天来再跑，这样就可以
: 算到时间了。如果你跑的是biorad的mini胶的话，好象十多个小时就可以了，但前面的
: 预跑很麻烦。
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B*****e
发帖数: 1005 | 40 真抱歉，很多年前做得，具体的数据都忘记了，只隐约记得哪些步骤比较麻烦，如果让
我再做一次，我肯定很多都能想得起来。
印象中，在pre-run的时候，需要在dye中加一些特别的试剂。在pre-run的时候，我也
把dye给run出胶，我记得buffer好象需要在pre-run后需要更换，因为这种buffer的缓
冲能力不太强。另外，在run的时候特别易产热，需要在cold room中进行。
【在 s******y 的大作中提到】
: pre-run会有什么麻烦？
: 在这种情况下你一般预跑多久？
: 你说的以dye跑不了胶为基准是不是指以dye不会动为基准？还是说dye跑不出胶
: 的末端为基准？
: 我对这个没有什么经验，请指教：）
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s******y
发帖数: 28562 | 41 Thanks!
【在 B*****e 的大作中提到】
: 真抱歉，很多年前做得，具体的数据都忘记了，只隐约记得哪些步骤比较麻烦，如果让
: 我再做一次，我肯定很多都能想得起来。
: 印象中，在pre-run的时候，需要在dye中加一些特别的试剂。在pre-run的时候，我也
: 把dye给run出胶，我记得buffer好象需要在pre-run后需要更换，因为这种buffer的缓
: 冲能力不太强。另外，在run的时候特别易产热，需要在cold room中进行。
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