s*********t
发帖数: 600 | 1 筛一个带tag外源蛋白的over expression stable cell line 用于纯化complex。
挑的colony在6孔板里做wb，有好几个阳性克隆。
我选了一个克隆，现在扩增到两个10cm 板了，再做wb，没有表达了（我wb没问题，有
阳性对照。）
一直都是加药的（puro）。
这是怎么回事啊？已经建好的stable cell line还会消失吗？ |
s******u
发帖数: 81 | 2 大概筛了多久开始挑克隆？时间太短有太多假阳性，比如2-3周。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 筛一个带tag外源蛋白的over expression stable cell line 用于纯化complex。
: 挑的colony在6孔板里做wb，有好几个阳性克隆。
: 我选了一个克隆，现在扩增到两个10cm 板了，再做wb，没有表达了（我wb没问题，有
: 阳性对照。）
: 一直都是加药的（puro）。
: 这是怎么回事啊？已经建好的stable cell line还会消失吗？
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s*********t
发帖数: 600 | 3 汗，就是2周多点。细胞都死光了呀，只留下细胞团克隆了，我就挑了。
为什么会有假阳性啊？是说慢慢的，那些表达蛋白的细胞又会死掉吗？
【在 s******u 的大作中提到】
: 大概筛了多久开始挑克隆？时间太短有太多假阳性，比如2-3周。
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B******o
发帖数: 496 | 4 你质粒转染前切成单链了么？如果没切过，质粒在整合到染色体上前会随机的断在某个
位置，如果正好在你的目标蛋白coding sequence里蛋白就挂了，所以是可能出现假阳
性的
【在 s*********t 的大作中提到】
: 汗，就是2周多点。细胞都死光了呀，只留下细胞团克隆了，我就挑了。
: 为什么会有假阳性啊？是说慢慢的，那些表达蛋白的细胞又会死掉吗？
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H****s
发帖数: 301 | 5 对于puromycin抗性的克隆筛选来说，这种情况是非常普遍的。看看你的载体吧，如果
标靶基因和puromycin抗性是由不同的启动子驱动的，那么你运气不太好，需要多筛选
克隆。主要有两种解释：（1）lentiviral/retroviral载体介导的异源表达，很普遍的
一个现象是整合到基因组的序列被flanking genomic sequences灭活。具体怎么回事，
现在还不太好解释。（2）低表达或者是不表达的细胞outgrow表达标靶蛋白的细胞，所
以，几代以后，你基本上丧失标靶蛋白的表达。
有两个建议：
（1）。使用抗性基因和标靶基因被同一启动子驱动的载体。标靶基因和抗性基因中间
有IRES。这样，产生抗性的细胞系必然表达标靶蛋白。如果被flanking genomic
sequences灭活的话，细胞会死亡，因为抗性丢失。
（2）。如果筛选到合适的细胞系，在前面几代要多冻存细胞。这样在后面的实验中你
不会丢失辛辛苦苦得来的细胞系。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 筛一个带tag外源蛋白的over expression stable cell line 用于纯化complex。
: 挑的colony在6孔板里做wb，有好几个阳性克隆。
: 我选了一个克隆，现在扩增到两个10cm 板了，再做wb，没有表达了（我wb没问题，有
: 阳性对照。）
: 一直都是加药的（puro）。
: 这是怎么回事啊？已经建好的stable cell line还会消失吗？
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d*p
发帖数: 534 | |
j******i
发帖数: 939 | 7 It's not surprising that transgene is silenced after two weeks or longer
time. The reason could be inserted into heterochromatin, or methylation.
However, those colonies might still be resistant to puro because of high
density. |
