h**********8
发帖数: 650 | 1 在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用，难道切掉tag，
过个胶，不能分离吗？
请大牛们解答：药用蛋白如何纯化？如果有相关书籍，还请推荐！ |
j****x
发帖数: 1704 | 2 Therapeutic Proteins : Methods and Protocols
http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
切掉His-taq再纯化理论上当然没问题，但是存在不少不确定因素：folding、酶切效率
、得率等，当然最最重要的是成本。对罗某某而言，最重要的显然是以最简单的步骤和
最低的成本包装上市，其他的对他而言无足轻重了。 |
s********n
发帖数: 2939 | 3 以前参加GE training的时候问过很多Pharma的人，他们认为Ni leackage是最大问题。 |
a******g
发帖数: 71 | 4 endostatin不是简单地一步Ni柱纯化，据我了解，应该是首先破菌，分离包涵体，充分
洗涤包涵体（洗涤过后纯度就达到90%），然后8M urea溶解，过Ni柱，然后有一步最关
键的refolding，也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
bond，在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后，50%以上的endostatin能
以可溶性单体存在，其他不能refold的则聚集形成胶体，经盐诱导沉淀后与refolding
成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%，银染无杂带。整个工艺应该还是非常
impressive的。
我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
【在 h**********8 的大作中提到】
: 在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用，难道切掉tag，
: 过个胶，不能分离吗？
: 请大牛们解答：药用蛋白如何纯化？如果有相关书籍，还请推荐！
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u*******r
发帖数: 27 | 5 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题：
1.immunogenicity
这也就是要切去his的原因，虽然his的免疫原性不高，但是还是有的。这所产生的
immunogenicty不仅使其可能对人体有害，还会complicate the whole efficacy
studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
compromise the eeficacy?
2. 提存和处理过程中的杂质。
其中包括内毒素，各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
refolding
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin不是简单地一步Ni柱纯化，据我了解，应该是首先破菌，分离包涵体，充分
: 洗涤包涵体（洗涤过后纯度就达到90%），然后8M urea溶解，过Ni柱，然后有一步最关
: 键的refolding，也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
: bond，在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后，50%以上的endostatin能
: 以可溶性单体存在，其他不能refold的则聚集形成胶体，经盐诱导沉淀后与refolding
: 成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%，银染无杂带。整个工艺应该还是非常
: impressive的。
: 我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
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a******g
发帖数: 71 | 6 endostatin的refolding是一件极其困难的事情，Folkman最早的paper里他们提到有99%
的蛋白沉淀而无法复性，所以罗的工艺在此处有独到之处。
罗的工艺基本是遵循纯化，复性，再纯化（不依赖Ni柱）的途径，最后产品纯度高当然
不只是蛋白质，并且元素检验也没有Ni残留，至于你说的endotoxin更是检测不出。
如果你不了解具体的过程，就不要着急trivialize别人的东西。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题：
: 1.immunogenicity
: 这也就是要切去his的原因，虽然his的免疫原性不高，但是还是有的。这所产生的
: immunogenicty不仅使其可能对人体有害，还会complicate the whole efficacy
: studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
: compromise the eeficacy?
: 2. 提存和处理过程中的杂质。
: 其中包括内毒素，各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
: 其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
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s********n
发帖数: 2939 | 7 既然这么牛为啥不切掉His-tag?
99%
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin的refolding是一件极其困难的事情，Folkman最早的paper里他们提到有99%
: 的蛋白沉淀而无法复性，所以罗的工艺在此处有独到之处。
: 罗的工艺基本是遵循纯化，复性，再纯化（不依赖Ni柱）的途径，最后产品纯度高当然
: 不只是蛋白质，并且元素检验也没有Ni残留，至于你说的endotoxin更是检测不出。
: 如果你不了解具体的过程，就不要着急trivialize别人的东西。
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a******g
发帖数: 71 | 8 这是另外一个范畴的问题，与罗的复性工艺本身无关。
【在 s********n 的大作中提到】
: 既然这么牛为啥不切掉His-tag?
:
: 99%
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u*******r
发帖数: 27 | 9 我没有trivialize。
遇到过一个在他实验室中干过的兄弟，提到其提纯还是运用了Ni柱。此外，所有的蛋白
都是从inclusion body中来，当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
是最终产物时常有aggregate，但就是遮着掩着。
99%
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin的refolding是一件极其困难的事情，Folkman最早的paper里他们提到有99%
: 的蛋白沉淀而无法复性，所以罗的工艺在此处有独到之处。
: 罗的工艺基本是遵循纯化，复性，再纯化（不依赖Ni柱）的途径，最后产品纯度高当然
: 不只是蛋白质，并且元素检验也没有Ni残留，至于你说的endotoxin更是检测不出。
: 如果你不了解具体的过程，就不要着急trivialize别人的东西。
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a******g
发帖数: 71 | 10 第一步从包涵体中纯化是用Ni柱，第一步结束之后需要透析到酸性环境下除去所有尿素
且确保不沉淀，然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对，然后有一个再纯化的
过程去除没有复性而聚集的蛋白，这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC，走gel
filtration，结果都非常好。
在实验室里，罗从来不会公布复性的方法，因为这个是商业机密，没有哪个学生知道。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 我没有trivialize。
: 遇到过一个在他实验室中干过的兄弟，提到其提纯还是运用了Ni柱。此外，所有的蛋白
: 都是从inclusion body中来，当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
: 是最终产物时常有aggregate，但就是遮着掩着。
:
: 99%
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s********n
发帖数: 2939 | 11 难道复性实验他自己做？
【在 a******g 的大作中提到】
: 第一步从包涵体中纯化是用Ni柱，第一步结束之后需要透析到酸性环境下除去所有尿素
: 且确保不沉淀，然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对，然后有一个再纯化的
: 过程去除没有复性而聚集的蛋白，这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC，走gel
: filtration，结果都非常好。
: 在实验室里，罗从来不会公布复性的方法，因为这个是商业机密，没有哪个学生知道。
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a******g
发帖数: 71 | 12 复性实验公司做，样品直接送到实验室。
【在 s********n 的大作中提到】
: 难道复性实验他自己做？
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s********n
发帖数: 2939 | 13 看来老兄很了解他们实验室啊，呵呵。
【在 a******g 的大作中提到】
: 复性实验公司做，样品直接送到实验室。
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s********n
发帖数: 2939 | 14 这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗？ |
j****x
发帖数: 1704 | 15 产量和纯化会是更大的问题，成本自然就级数增长了
如果能获得相似活性的蛋白产物，那么显然大肠杆菌表达系统是最佳的选择了
【在 s********n 的大作中提到】
: 这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗？
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u*******r
发帖数: 27 | 16 其学生有去公司中做的。
国内特色之一。
相信在国外的TZ都想国内多做原创性的东西，但是，这是吗？如果真是大牛东西，为什
么这一在美国当年轰动一是的药物，没有人从国内购买。据说当时国外公司要看临床数
据，罗也说是商业机密不给看。是不是什么都可用商业机密一叶遮目。
【在 a******g 的大作中提到】
: 复性实验公司做，样品直接送到实验室。
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a******g
发帖数: 71 | 17 首先这个是extracellular protein，在细胞内还原环境下表达无法形成正确的S-S键配
对。除非弄成分泌到胞外的然后从培养基里纯化。
其次真核表达和大肠感觉相比产量差别太大了，罗生产endostatin是按kilograms来算
的。
【在 s********n 的大作中提到】
: 这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗？
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a******g
发帖数: 71 | 18 也许后来有学生去做复性，那个我并不了解，所以也不好说。
临床数据没有保密，06年罗来Children's hospital Boston做报告，展示了不少三期临
床的数据。一期二期的结果我也都看到过，这个不是保密的。
当然了，效果确实比较modest，并且作用机理不明，其免疫原性是否起作用也不是十分
清楚，并且不能单独用药，需要与taxol联合用。但是所有的蛋白类抗癌药都得和一线
化疗药联合用。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 其学生有去公司中做的。
: 国内特色之一。
: 相信在国外的TZ都想国内多做原创性的东西，但是，这是吗？如果真是大牛东西，为什
: 么这一在美国当年轰动一是的药物，没有人从国内购买。据说当时国外公司要看临床数
: 据，罗也说是商业机密不给看。是不是什么都可用商业机密一叶遮目。
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s********n
发帖数: 2939 | 19 这个我当然理解，但是现在大部分的药用蛋白都是CHO cell表达的，虽然成本高，但是
能够正确折叠，而且有正确翻译后修饰。
【在 j****x 的大作中提到】
: 产量和纯化会是更大的问题，成本自然就级数增长了
: 如果能获得相似活性的蛋白产物，那么显然大肠杆菌表达系统是最佳的选择了
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s********n
发帖数: 2939 | 20 insect or CHO cell也是可以分泌表达的。
【在 a******g 的大作中提到】
: 首先这个是extracellular protein，在细胞内还原环境下表达无法形成正确的S-S键配
: 对。除非弄成分泌到胞外的然后从培养基里纯化。
: 其次真核表达和大肠感觉相比产量差别太大了，罗生产endostatin是按kilograms来算
: 的。
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u*******r
发帖数: 27 | 21 的确，CHO可以表达。而且现在由于产量可以达到5g/L， 所以平均生产成本到了30美元
/g，AMGEN还提到其生产成本6美元/g.
另一个问题：endostatin到底有没有效？
【在 s********n 的大作中提到】
: insect or CHO cell也是可以分泌表达的。
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u*******r
发帖数: 27 | 22 国外药物公司要看原始临床数据，而不是整理发表的。
【在 a******g 的大作中提到】
: 也许后来有学生去做复性，那个我并不了解，所以也不好说。
: 临床数据没有保密，06年罗来Children's hospital Boston做报告，展示了不少三期临
: 床的数据。一期二期的结果我也都看到过，这个不是保密的。
: 当然了，效果确实比较modest，并且作用机理不明，其免疫原性是否起作用也不是十分
: 清楚，并且不能单独用药，需要与taxol联合用。但是所有的蛋白类抗癌药都得和一线
: 化疗药联合用。
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a******g
发帖数: 71 | 23 三期临床显示有modest效果。
作用机理不明的状况下，很难对疗效问题作出准确回答。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 的确，CHO可以表达。而且现在由于产量可以达到5g/L， 所以平均生产成本到了30美元
: /g，AMGEN还提到其生产成本6美元/g.
: 另一个问题：endostatin到底有没有效？
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j****x
发帖数: 1704 | 24 所以我说前提是能获得相似活性的产物啊，如果活性不行，那自然还得真核表达。
举个最简单的例子，重组人干扰素，早期都是大肠杆菌表达，后来真核表达发现活性提
高一千倍有余，dose啊副作用啊显著降低了，那显然用真核表达的好。即便如此，目前
原核表达的一样卖的很好，成本这东西，企业的命门
不过07年国内新版药典颁布后，以后CHO都不让用了，郁闷了一大帮
【在 s********n 的大作中提到】
: 这个我当然理解，但是现在大部分的药用蛋白都是CHO cell表达的，虽然成本高，但是
: 能够正确折叠，而且有正确翻译后修饰。
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a******g
发帖数: 71 | 25 据我所知，Johnson and Johnson已经准备和罗合作开发长效endostatin并在美国开始
上临床实验了，我不知道具体细节但是我猜想中国的原始临床数据他们会要求看的。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 国外药物公司要看原始临床数据，而不是整理发表的。
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a**o
发帖数: 108 | 26 这是因为，his-tag可以增加这个蛋白的稳定性。你要是有兴趣可以自己试试。
去掉了his-tag很容易就沉了。
btw,这个蛋白的改造不是罗搞得，是我phd老板做的。他们当时在合作。
【在 s********n 的大作中提到】
: 既然这么牛为啥不切掉His-tag?
:
: 99%
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s********n
发帖数: 2939 | 27 CHO不让用，那得用啥？
【在 j****x 的大作中提到】
: 所以我说前提是能获得相似活性的产物啊，如果活性不行，那自然还得真核表达。
: 举个最简单的例子，重组人干扰素，早期都是大肠杆菌表达，后来真核表达发现活性提
: 高一千倍有余，dose啊副作用啊显著降低了，那显然用真核表达的好。即便如此，目前
: 原核表达的一样卖的很好，成本这东西，企业的命门
: 不过07年国内新版药典颁布后，以后CHO都不让用了，郁闷了一大帮
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u*******r
发帖数: 27 | 28 5年前就听说要和Pfizer， JJ,Onyx谈了。结果一要原始数据就以商业机密而拒绝。
【在 a******g 的大作中提到】
: 据我所知，Johnson and Johnson已经准备和罗合作开发长效endostatin并在美国开始
: 上临床实验了，我不知道具体细节但是我猜想中国的原始临床数据他们会要求看的。
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s********n
发帖数: 2939 | 29 有意思，不过就不用试了，我也不是做这方面的。只是好奇到时候要FDA approval的时
候可能会很麻烦。
【在 a**o 的大作中提到】
: 这是因为，his-tag可以增加这个蛋白的稳定性。你要是有兴趣可以自己试试。
: 去掉了his-tag很容易就沉了。
: btw,这个蛋白的改造不是罗搞得，是我phd老板做的。他们当时在合作。
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a**o
发帖数: 108 | 30 是挺麻烦的。。。中国当时也挺麻烦的。
大家都知道那玩意有抗原性啊。
不过当时做的时候最初的目的只是提高稳定性，没想一定要做药。
【在 s********n 的大作中提到】
: 有意思，不过就不用试了，我也不是做这方面的。只是好奇到时候要FDA approval的时
: 候可能会很麻烦。
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h**********8
发帖数: 650 | 31 太感谢啦！！！
【在 j****x 的大作中提到】
: Therapeutic Proteins : Methods and Protocols
: http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
: 切掉His-taq再纯化理论上当然没问题，但是存在不少不确定因素：folding、酶切效率
: 、得率等，当然最最重要的是成本。对罗某某而言，最重要的显然是以最简单的步骤和
: 最低的成本包装上市，其他的对他而言无足轻重了。
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h**********8
发帖数: 650 | 32 貌似卖给先声了？
感谢楼上各位大牛科普！！！
【在 u*******r 的大作中提到】
: 5年前就听说要和Pfizer， JJ,Onyx谈了。结果一要原始数据就以商业机密而拒绝。
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