p********t
发帖数: 411 | 1 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。 |
A******y
发帖数: 2041 | 2 Usually is the antibody that is not good enough, and to find a good one
could be costly (~$300 a try if no one have one lying around in the lab).
Yes, RT-PCR is completely B.S., also transcription regulation are mostly
long term responses...most pathways are not through transcription regulation
. |
s******s
发帖数: 13035 | 3 没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的
【在 p********t 的大作中提到】
: 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
: 最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
: PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。
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v***a
发帖数: 1242 | 4 是啊 说到这个我就很伤心 现在在做的一个蛋白 外面的抗体买了5个 自己做了2个
都不行 发表paper的时候看来也能用PCR充数了
【在 s******s 的大作中提到】
: 没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
: 就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的
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s*******p
发帖数: 205 | 5 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
【在 v***a 的大作中提到】
: 是啊 说到这个我就很伤心 现在在做的一个蛋白 外面的抗体买了5个 自己做了2个
: 都不行 发表paper的时候看来也能用PCR充数了
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O******e
发帖数: 4845 | 6 同伤心同伤心。我的一个蛋白也是把能买的买遍外加自己做的几个，都不行。。。
【在 v***a 的大作中提到】
: 是啊 说到这个我就很伤心 现在在做的一个蛋白 外面的抗体买了5个 自己做了2个
: 都不行 发表paper的时候看来也能用PCR充数了
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h*******n
发帖数: 2052 | 7 same here
【在 s*******p 的大作中提到】
: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
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K******S
发帖数: 10109 | 8 time to try MRM
【在 s*******p 的大作中提到】
: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
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c********b
发帖数: 363 | 9 比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。
【在 h*******n 的大作中提到】
: same here
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h*******n
发帖数: 2052 | |
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c********b
发帖数: 363 | 11 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）twice, 5min each，collect supernatant leave on ice, use 1
／10 volumn Tris（pH8）neutrolize，Make sure pH around7，Per 1ml elute add 0
.4g ammonium sulfate，dissolve well，leave in 4 degree 30min，4000 rpm 30
min spin，dissolve pellet in 1 ml 1XTBS， dialysis twice against 1XTBS （6hr
each）.collect Ab and add 0.02% sodium azide.
【在 h*******n 的大作中提到】
: 很多杂带， KO里也有
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p********t
发帖数: 411 | 12 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。 |
A******y
发帖数: 2041 | 13 Usually is the antibody that is not good enough, and to find a good one
could be costly (~$300 a try if no one have one lying around in the lab).
Yes, RT-PCR is completely B.S., also transcription regulation are mostly
long term responses...most pathways are not through transcription regulation
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s******s
发帖数: 13035 | 14 没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的
【在 p********t 的大作中提到】
: 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
: 最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
: PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。
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v***a
发帖数: 1242 | 15 是啊 说到这个我就很伤心 现在在做的一个蛋白 外面的抗体买了5个 自己做了2个
都不行 发表paper的时候看来也能用PCR充数了
【在 s******s 的大作中提到】
: 没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
: 就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的
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s*******p
发帖数: 205 | 16 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
【在 v***a 的大作中提到】
: 是啊 说到这个我就很伤心 现在在做的一个蛋白 外面的抗体买了5个 自己做了2个
: 都不行 发表paper的时候看来也能用PCR充数了
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O******e
发帖数: 4845 | 17 同伤心同伤心。我的一个蛋白也是把能买的买遍外加自己做的几个，都不行。。。
【在 v***a 的大作中提到】
: 是啊 说到这个我就很伤心 现在在做的一个蛋白 外面的抗体买了5个 自己做了2个
: 都不行 发表paper的时候看来也能用PCR充数了
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h*******n
发帖数: 2052 | 18 same here
【在 s*******p 的大作中提到】
: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
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K******S
发帖数: 10109 | 19 time to try MRM
【在 s*******p 的大作中提到】
: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
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c********b
发帖数: 363 | 20 比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。
【在 h*******n 的大作中提到】
: same here
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h*******n
发帖数: 2052 | |
c********b
发帖数: 363 | 22 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）twice, 5min each，collect supernatant leave on ice, use 1
／10 volumn Tris（pH8）neutrolize，Make sure pH around7，Per 1ml elute add 0
.4g ammonium sulfate，dissolve well，leave in 4 degree 30min，4000 rpm 30
min spin，dissolve pellet in 1 ml 1XTBS， dialysis twice against 1XTBS （6hr
each）.collect Ab and add 0.02% sodium azide.
【在 h*******n 的大作中提到】
: 很多杂带， KO里也有
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c****g
发帖数: 93 | 23 我们经常做2个不同tag的表达，一个immno rabbat；一个来purify IgG。
his
【在 c********b 的大作中提到】
: 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
: 如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
: 会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
: sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
: 如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
: －tag提出来的多。
: 要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
: 特异。还有就是不太适用于IP。
: 这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
: his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
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c****g
发帖数: 93 | 24 confirm ur KO mice once again.
【在 s*******p 的大作中提到】
: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。
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h*******o
发帖数: 4884 | 25 I agree.
Usually if an antibody from a reliable vendor yields such specific band, I
will double check with the mouse colony.
Also, if the purified protein/peptide is available, I will try pre-absorbed
antibody as a negative control.
【在 c****g 的大作中提到】
: confirm ur KO mice once again.
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n********k
发帖数: 2818 | 26 I literally spent at least 20k and a half year to work out one staining....after several
others tried for several months to year...Now, people are asking for my
protocols just like that without least appreciation of how much I have put
into it...
【在 O******e 的大作中提到】
: 同伤心同伤心。我的一个蛋白也是把能买的买遍外加自己做的几个，都不行。。。
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