f*******e
发帖数: 354 | 1 为什么不能直接裂解在最终的IP buffer里头，如果可以用机械法等各种方法解决细胞
破碎的问题，求达人赐教 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 分情况。
有的是古代的时候大家就是用那个溶液来裂解细胞的，后来有了其他方法大家也懒得去
换溶液。
有的则是因为某些酶需要在裂解细胞的时候用某些盐来抑制
有的则是因为某些蛋白是聚合体，需要先用比较高的盐来让他们分开。
【在 f*******e 的大作中提到】
: 为什么不能直接裂解在最终的IP buffer里头，如果可以用机械法等各种方法解决细胞
: 破碎的问题，求达人赐教
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s*********t
发帖数: 600 | 3 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
是浑浊的东西。
对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
，作为nuclear extract。
不知道液氮速冻这一步对于防止蛋白变性有好处，还是别的原因？为何需要速冻？
如果用于蛋白复合物的纯化，我以前是用300mM的盐。但是boss让我改成250mM。
文献上一般是透析至少4h到300mM或者250mM。但是我觉得透析后有很多沉淀，直接用
0mM 盐的buffer，稀释至300/250mM，不知道这样好不好？稀释后，其实还是会有沉淀
，我一般再次离心1.2万g 30min。
另外，我们实验室还有人在pellet那一步，直接加250mM盐溶液，然后超声，然后加
benzonase，4度过夜。他说这样能得到更多蛋白，同样的细胞得到3倍于我的方法得到
的蛋白量。不过我怀疑得到的更多的只是无效蛋白？
求大牛解释下，我一直一直非常困惑。
【在 s******y 的大作中提到】
: 分情况。
: 有的是古代的时候大家就是用那个溶液来裂解细胞的，后来有了其他方法大家也懒得去
: 换溶液。
: 有的则是因为某些酶需要在裂解细胞的时候用某些盐来抑制
: 有的则是因为某些蛋白是聚合体，需要先用比较高的盐来让他们分开。
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s*********t
发帖数: 600 | 4 另外，第一次得到的上清和细胞核pellet，我们实验室还有人再次用低盐溶液洗涤一次
细胞核pellet。可是我试过一次，细胞用homogenizer捣过之后，再离心，得到的
pellet已经有黏糊糊的倾向了，是不是细胞核也破碎了？如果再次洗涤，我担心细胞核
蛋白会损失。所以我都不洗涤。
所以做western检测quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。
所以我现在最烦做从大量细胞制备NE，S100的实验，因为跟文献的方法总是有些修改，不同的文献使用
的方法也不同，同个实验室，不同的人用的都不同，让我无所适从。 |
i***l
发帖数: 1656 | 5 你自己应该能回答这些问题，do you have QC assay? pos. ctl?
们这没有这
悬浮着，得到的
80
【在 s*********t 的大作中提到】
: 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
: 比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
: harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
: homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
: 体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
: 样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
: S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
: 是浑浊的东西。
: 对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
: 西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
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s*********t
发帖数: 600 | 6 你说的QC assay是什么？
我做western检测NE和CE的quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone
），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。不过这些都是粗蛋白总蛋白，怎么进一步检测呢？
我担心的一是破碎细胞之后的细胞核pellet已经像鼻涕了，是不是细胞核也被弄破了？
然后NE和CE各自有少量互相污染。
二是透析会产生大量沉淀，直接稀释也会产生很多沉淀。也许你要研究的未知蛋白就在
这些沉淀里面呢 。。。
我查了n多文献，从80年代的方法到现在的，都不相同。同一个实验室，不同人各自的
做法也有差异。
无所适从啊。
【在 i***l 的大作中提到】
: 你自己应该能回答这些问题，do you have QC assay? pos. ctl?
:
: 们这没有这
: 悬浮着，得到的
: 80
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f*******e
发帖数: 354 | 7 我在想，除了破碎细胞，高盐低盐是不是对蛋白的释放有作用啊，可是细胞都破了，蛋
白还没有释放，就是不懂，为什么要搞透析这一步
Histone
【在 s*********t 的大作中提到】
: 你说的QC assay是什么？
: 我做western检测NE和CE的quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone
: ），NE
: 里面混有少量CE （anti GAPDH）。不过这些都是粗蛋白总蛋白，怎么进一步检测呢？
: 我担心的一是破碎细胞之后的细胞核pellet已经像鼻涕了，是不是细胞核也被弄破了？
: 然后NE和CE各自有少量互相污染。
: 二是透析会产生大量沉淀，直接稀释也会产生很多沉淀。也许你要研究的未知蛋白就在
: 这些沉淀里面呢 。。。
: 我查了n多文献，从80年代的方法到现在的，都不相同。同一个实验室，不同人各自的
: 做法也有差异。
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