v***a
发帖数: 1242 | 1 没有接触过KO mice，读paper碰到些问题想请教大家。KO mice得到的途径有很多种吗
？怎么来评估一只老鼠是否是彻底的KO呢？因为发现有一个gene的KO mice，是利用在
其两个exons之间插入另一个不相关的gene，来使其原蛋白丧失功能，研究发现此KO无
任何生理改变，一般行内都会就此得出结论说此蛋白对生物体来说是dispensable的吗
？但是后续有研究又发现，此KO mice体内有好几种此蛋白的变异体（由不同的exons变
换组合而成），而且KO和非KO的变异体种类和数目还略有差别。那这种还可以称之为KO
吗？还可以说此蛋白是dispensable的否？因为关于变异体的来源众说纷纭，有人还发
现有独特的mRNA对应于不同的变异体。所以也无法就确定说变异体就是由此蛋白的gene
来的。谢谢～ |
n******u
发帖数: 418 | 2 额。。。难道不先测测这个protein的expression或者其mRNA的level在ko mouse里面是
否真有变化么？ |
s******y
发帖数: 28562 | 3 判断KO 老鼠一般应该有两步：
1。 geneotyping,就是看该老鼠的基因里某蛋白的位置是否被成功搞乱了
2。 Western blot, 看目标蛋白是否真的消失了。
一般情况下，出现1 之后就会出现2，所以有的组因为偷懒，就只做了第一步。
但是这个是不严格的，有时候会出现象你说的那些漏网之鱼
KO
gene
【在 v***a 的大作中提到】
: 没有接触过KO mice，读paper碰到些问题想请教大家。KO mice得到的途径有很多种吗
: ？怎么来评估一只老鼠是否是彻底的KO呢？因为发现有一个gene的KO mice，是利用在
: 其两个exons之间插入另一个不相关的gene，来使其原蛋白丧失功能，研究发现此KO无
: 任何生理改变，一般行内都会就此得出结论说此蛋白对生物体来说是dispensable的吗
: ？但是后续有研究又发现，此KO mice体内有好几种此蛋白的变异体（由不同的exons变
: 换组合而成），而且KO和非KO的变异体种类和数目还略有差别。那这种还可以称之为KO
: 吗？还可以说此蛋白是dispensable的否？因为关于变异体的来源众说纷纭，有人还发
: 现有独特的mRNA对应于不同的变异体。所以也无法就确定说变异体就是由此蛋白的gene
: 来的。谢谢～
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z*******o
发帖数: 1794 | 4 汗，我所在的实验室从来只做geneotyping， 没有做过western。
我都建议过好几次了，大家不care，于是我该干嘛干嘛。
【在 s******y 的大作中提到】
: 判断KO 老鼠一般应该有两步：
: 1。 geneotyping,就是看该老鼠的基因里某蛋白的位置是否被成功搞乱了
: 2。 Western blot, 看目标蛋白是否真的消失了。
: 一般情况下，出现1 之后就会出现2，所以有的组因为偷懒，就只做了第一步。
: 但是这个是不严格的，有时候会出现象你说的那些漏网之鱼
:
: KO
: gene
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v***a
发帖数: 1242 | 5 western有时也不一定吧。就像我举例的这个蛋白，如果抗体正好不识别某种组合的
exon方式，那也检测不出啊
【在 z*******o 的大作中提到】
: 汗，我所在的实验室从来只做geneotyping， 没有做过western。
: 我都建议过好几次了，大家不care，于是我该干嘛干嘛。
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v***a
发帖数: 1242 | 6 谢谢！那又如何确保western的抗体一定能识别变异体呢？
【在 s******y 的大作中提到】
: 判断KO 老鼠一般应该有两步：
: 1。 geneotyping,就是看该老鼠的基因里某蛋白的位置是否被成功搞乱了
: 2。 Western blot, 看目标蛋白是否真的消失了。
: 一般情况下，出现1 之后就会出现2，所以有的组因为偷懒，就只做了第一步。
: 但是这个是不严格的，有时候会出现象你说的那些漏网之鱼
:
: KO
: gene
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n******u
发帖数: 418 | 7 遇到这种情况就多试几个抗体了
针对不同的exon
【在 v***a 的大作中提到】
: western有时也不一定吧。就像我举例的这个蛋白，如果抗体正好不识别某种组合的
: exon方式，那也检测不出啊
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n******u
发帖数: 418 | 8 如果变异体已知的话，就generate针对性的antiboy
或者用不同的mRNA probe做in situ，看RNA是否下降
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢！那又如何确保western的抗体一定能识别变异体呢？
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p*********e
发帖数: 23 | 9 你说的这种KO mice 好像是利用genetrap技术的knockout
不是传统的严格意义的KO mice
这个genetrap技术是有蛮多问题
传统的技术，是设计2个大的重组交换臂，可以把整合基因都换掉的，不存在这些似是
而非的问题
KO
gene
【在 v***a 的大作中提到】
: 没有接触过KO mice，读paper碰到些问题想请教大家。KO mice得到的途径有很多种吗
: ？怎么来评估一只老鼠是否是彻底的KO呢？因为发现有一个gene的KO mice，是利用在
: 其两个exons之间插入另一个不相关的gene，来使其原蛋白丧失功能，研究发现此KO无
: 任何生理改变，一般行内都会就此得出结论说此蛋白对生物体来说是dispensable的吗
: ？但是后续有研究又发现，此KO mice体内有好几种此蛋白的变异体（由不同的exons变
: 换组合而成），而且KO和非KO的变异体种类和数目还略有差别。那这种还可以称之为KO
: 吗？还可以说此蛋白是dispensable的否？因为关于变异体的来源众说纷纭，有人还发
: 现有独特的mRNA对应于不同的变异体。所以也无法就确定说变异体就是由此蛋白的gene
: 来的。谢谢～
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s******y
发帖数: 28562 | 10 用polyclonal anti-sera
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢！那又如何确保western的抗体一定能识别变异体呢？
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n******u
发帖数: 418 | 11 同源重组也是有长度限制的吧？
有些比较大的gene，经常看到也就是flank在某几个exon的边上，而不是全部替换掉
【在 p*********e 的大作中提到】
: 你说的这种KO mice 好像是利用genetrap技术的knockout
: 不是传统的严格意义的KO mice
: 这个genetrap技术是有蛮多问题
: 传统的技术，是设计2个大的重组交换臂，可以把整合基因都换掉的，不存在这些似是
: 而非的问题
:
: KO
: gene
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p*********e
发帖数: 23 | 12 也有这种情况
但楼主说“是利用在其两个exons之间插入另一个不相关的gene，来使其原蛋白丧失功
能”
所以严重怀疑是个genetrap knockout
后来楼主又提到“此KO mice体内有好几种此蛋白的变异体（由不同的exons变换组合而
成）”
我想这是指alternative splicing
一般用同源重组做KO时，可以在设计时避免alternative splicing的干扰。
【在 n******u 的大作中提到】
: 同源重组也是有长度限制的吧？
: 有些比较大的gene，经常看到也就是flank在某几个exon的边上，而不是全部替换掉
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D*a
发帖数: 6830 | 13 一般建老鼠系的时候，要genotype, southern western都做了来确认你的老鼠没有目标
蛋白表达，建立起来之后，就可以只做genotyping了。
如果是tissue specific的KO，交配完也要先做tissue specific PCR和 western确认，
cell specific的最好还能加IHC确认，然后之后的routine的交配可以只做genotype
我看的paper里面一般都会有PCR和werstern/IHC的图来表示这个蛋白是确实敲掉了的。
很多KO的mRNA转录很活跃，因为一般情况下你并没有动它的promoter. 但是一般情况下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个exon，你切了第10个想让他KO，但是恰好这个蛋白有两种长度形式，其中一个小的是利用了前面的9个exon，那么可能你就没有把这个小的(完全)敲掉。
但是蛋白的变异体的功能这个很难说啊，我觉得大部分应该是没活性的吧？ dispensable与否
要看是生理情况下还是challenge老鼠，很多KO是正常情况下没关系，但是有什么
stress的时候就会出现差别。很多paper重新做别人的东西，发现个把蛋白变异体或者
mRNA，然后就说新功能什么的，也存在为了发表文章夸大自己发现的情况，不可全信。 |
s******y
发帖数: 28562 | 14 zan
下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功
能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个
exon，你切了第10个想让他KO，但是恰好这个蛋白有两种长度形式，其中一个小的是利
用了前面的9个exon，那么可能你就没有把这个小的(完全)敲掉。
dispensable与否
【在 D*a 的大作中提到】
: 一般建老鼠系的时候，要genotype, southern western都做了来确认你的老鼠没有目标
: 蛋白表达，建立起来之后，就可以只做genotyping了。
: 如果是tissue specific的KO，交配完也要先做tissue specific PCR和 western确认，
: cell specific的最好还能加IHC确认，然后之后的routine的交配可以只做genotype
: 我看的paper里面一般都会有PCR和werstern/IHC的图来表示这个蛋白是确实敲掉了的。
: 很多KO的mRNA转录很活跃，因为一般情况下你并没有动它的promoter. 但是一般情况下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个exon，你切了第10个想让他KO，但是恰好这个蛋白有两种长度形式，其中一个小的是利用了前面的9个exon，那么可能你就没有把这个小的(完全)敲掉。
: 但是蛋白的变异体的功能这个很难说啊，我觉得大部分应该是没活性的吧？ dispensable与否
: 要看是生理情况下还是challenge老鼠，很多KO是正常情况下没关系，但是有什么
: stress的时候就会出现差别。很多paper重新做别人的东西，发现个把蛋白变异体或者
: mRNA，然后就说新功能什么的，也存在为了发表文章夸大自己发现的情况，不可全信。
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v***a
发帖数: 1242 | 15 谢谢专家的详尽解答！
下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功
能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个
exon，你切了第10个想让他KO
dispensable与否
【在 D*a 的大作中提到】
: 一般建老鼠系的时候，要genotype, southern western都做了来确认你的老鼠没有目标
: 蛋白表达，建立起来之后，就可以只做genotyping了。
: 如果是tissue specific的KO，交配完也要先做tissue specific PCR和 western确认，
: cell specific的最好还能加IHC确认，然后之后的routine的交配可以只做genotype
: 我看的paper里面一般都会有PCR和werstern/IHC的图来表示这个蛋白是确实敲掉了的。
: 很多KO的mRNA转录很活跃，因为一般情况下你并没有动它的promoter. 但是一般情况下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个exon，你切了第10个想让他KO，但是恰好这个蛋白有两种长度形式，其中一个小的是利用了前面的9个exon，那么可能你就没有把这个小的(完全)敲掉。
: 但是蛋白的变异体的功能这个很难说啊，我觉得大部分应该是没活性的吧？ dispensable与否
: 要看是生理情况下还是challenge老鼠，很多KO是正常情况下没关系，但是有什么
: stress的时候就会出现差别。很多paper重新做别人的东西，发现个把蛋白变异体或者
: mRNA，然后就说新功能什么的，也存在为了发表文章夸大自己发现的情况，不可全信。
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r*******y
发帖数: 48 | 16 any antibody against that particular knockout protein should work, no matter
which domain it is designed against, if that protein is really ablated. for
instance,if that protein has 20 exons, and you expect that the protein
after exon 10 is knocked out, but your antibody available is against the
exon 1. then, if it is a clean knockout, this antibody will detect a shoter
band than expected (i.e. from exon 1 to exon 9, but not a full length
protein). If you still detect a full length protein, then you need to
consider if it is a real knockout model, or if there is any leaking, which
is quite common in many knockout models derived from genetrap ES cells.
however, if you have an antibody against exon 11, then you will not be able
to detect any band in the knockout mouse sample, if it is a clean knockout.
The above mentioned is for conventional knockout. in the case of conditional
knockout, i.e. tissue specific or cell specific knockout, the situation
will be more complicated. you need to compare wild type and cKO to see how
much protein can be removed.
下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功
能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个
exon，你切了第10个想让他KO，但是恰好这个蛋白有两种长度形式，其中一个小的是利
用了前面的9个exon，那么可能你就没有把这个小的(完全)敲掉。
dispensable与否
【在 D*a 的大作中提到】
: 一般建老鼠系的时候，要genotype, southern western都做了来确认你的老鼠没有目标
: 蛋白表达，建立起来之后，就可以只做genotyping了。
: 如果是tissue specific的KO，交配完也要先做tissue specific PCR和 western确认，
: cell specific的最好还能加IHC确认，然后之后的routine的交配可以只做genotype
: 我看的paper里面一般都会有PCR和werstern/IHC的图来表示这个蛋白是确实敲掉了的。
: 很多KO的mRNA转录很活跃，因为一般情况下你并没有动它的promoter. 但是一般情况下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个exon，你切了第10个想让他KO，但是恰好这个蛋白有两种长度形式，其中一个小的是利用了前面的9个exon，那么可能你就没有把这个小的(完全)敲掉。
: 但是蛋白的变异体的功能这个很难说啊，我觉得大部分应该是没活性的吧？ dispensable与否
: 要看是生理情况下还是challenge老鼠，很多KO是正常情况下没关系，但是有什么
: stress的时候就会出现差别。很多paper重新做别人的东西，发现个把蛋白变异体或者
: mRNA，然后就说新功能什么的，也存在为了发表文章夸大自己发现的情况，不可全信。
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y**********n
发帖数: 478 | 17 sunnyday 的妹妹？
matter
for
shoter
able
【在 r*******y 的大作中提到】
: any antibody against that particular knockout protein should work, no matter
: which domain it is designed against, if that protein is really ablated. for
: instance,if that protein has 20 exons, and you expect that the protein
: after exon 10 is knocked out, but your antibody available is against the
: exon 1. then, if it is a clean knockout, this antibody will detect a shoter
: band than expected (i.e. from exon 1 to exon 9, but not a full length
: protein). If you still detect a full length protein, then you need to
: consider if it is a real knockout model, or if there is any leaking, which
: is quite common in many knockout models derived from genetrap ES cells.
: however, if you have an antibody against exon 11, then you will not be able
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j******2
发帖数: 544 | 18 搭车求教，这个KO老鼠和KO老鼠交配，生下的小鼠都肯定是KO吗？有没有可能n代之后
出生的小鼠就不再KO、恢复野生型了？ |
s******y
发帖数: 28562 | 19 用传统方法做出的KO没有这个恢性的可能。
对于gene trap KO 倒是有可能的
【在 j******2 的大作中提到】
: 搭车求教，这个KO老鼠和KO老鼠交配，生下的小鼠都肯定是KO吗？有没有可能n代之后
: 出生的小鼠就不再KO、恢复野生型了？
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s******y
发帖数: 28562 | 20 Lol
才突然注意到这个
【在 y**********n 的大作中提到】
: sunnyday 的妹妹？
:
: matter
: for
: shoter
: able
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