m******5
发帖数: 1383 | 1 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
麻烦来了
1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
commercial的 |
O******e
发帖数: 4845 | 2 1. Most likly.
2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗
位置
【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
: 想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
: endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
: 现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
: 麻烦来了
: 1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
: 我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
: 2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
: commercial的
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m******5
发帖数: 1383 | 3 1,most likely yes or no?
【在 O******e 的大作中提到】
: 1. Most likly.
: 2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗
:
: 位置
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O******e
发帖数: 4845 | 4 yes
【在 m******5 的大作中提到】
: 1,most likely yes or no?
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m******5
发帖数: 1383 | 5 Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
正四处找commercial的
【在 O******e 的大作中提到】
: 1. Most likly.
: 2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗
:
: 位置
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s******r
发帖数: 2876 | 6 马上做一个大肠杆菌的表达construct.
共转大肠杆菌不就行了。
Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
正四处找commercial的
【在 m******5 的大作中提到】
: Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
: 我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
: 正四处找commercial的
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m******5
发帖数: 1383 | 7 that takes time...
【在 s******r 的大作中提到】
: 马上做一个大肠杆菌的表达construct.
: 共转大肠杆菌不就行了。
:
: Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
: 我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
: 正四处找commercial的
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s******a
发帖数: 472 | 8 当时为什么不设计成反向呢
位置
【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
: 想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
: endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
: 现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
: 麻烦来了
: 1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
: 我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
: 2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
: commercial的
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a******8
发帖数: 56 | 9 In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
PCR for 3'UTR or others)? Good luck. |
m******5
发帖数: 1383 | 10 because they use reversed direction...
【在 a******8 的大作中提到】
: In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
: Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
: endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
: transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
: PCR for 3'UTR or others)? Good luck.
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s******r
发帖数: 2876 | 11 最多一个礼拜，你跟别人要来菌株也差不多时间。
that takes time...
【在 m******5 的大作中提到】
: that takes time...
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a******8
发帖数: 56 | 12 Not necessarily.the mRNA splicing from the same genomic locus can be
different when using different promoters. There are many successful examples
when NeoR is in forward direction.
【在 m******5 的大作中提到】
: because they use reversed direction...
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m******5
发帖数: 1383 | 13 even in my case ? it
is in between of my last exon and 3,utr
【在 a******8 的大作中提到】
: Not necessarily.the mRNA splicing from the same genomic locus can be
: different when using different promoters. There are many successful examples
: when NeoR is in forward direction.
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m******5
发帖数: 1383 | 14 I actually want to take advantage of the polya downstream of neo in case I
don't want to pursue 3,utr function
【在 s******a 的大作中提到】
: 当时为什么不设计成反向呢
:
: 位置
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m******5
发帖数: 1383 | 15 而且我手头没有选择标签for co transfection...
【在 s******r 的大作中提到】
: 马上做一个大肠杆菌的表达construct.
: 共转大肠杆菌不就行了。
:
: Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
: 我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
: 正四处找commercial的
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g***y
发帖数: 201 | 16 不是很明白为什么要在bacteria里面删除neo, 难道不用在ES cell里做selection么？
SW105 has an arabinose-inducible flpe gene ,做bac recombineering 的 lab不是
通常都有sw102,105,106系列菌株么？
位置
【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
: 想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
: endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
: 现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
: 麻烦来了
: 1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
: 我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
: 2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
: commercial的
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m******5
发帖数: 1383 | 17 有另外一个marker 筛选
【在 g***y 的大作中提到】
: 不是很明白为什么要在bacteria里面删除neo, 难道不用在ES cell里做selection么？
: SW105 has an arabinose-inducible flpe gene ,做bac recombineering 的 lab不是
: 通常都有sw102,105,106系列菌株么？
:
: 位置
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s******r
发帖数: 2876 | 18 找找周围的实验室，要个vector。
而且我手头没有选择标签for co transfection...
【在 m******5 的大作中提到】
: 而且我手头没有选择标签for co transfection...
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m******5
发帖数: 1383 | 19 though it is not directly relevant to my post, I still apreciate that!!thank
you! |
