T*****e 发帖数: 247 | 1 又到周末了,大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多,我在这里抛砖引
玉,挑战一下大家。
第一次挑战的题目:如何设计果蝇中的最强荧光报告基因?
简单的背景:
果蝇作为重要的模式生物,个体小,生长周期短,易于饲养,易于观察,染色体数目少
,能吃能睡能学习,各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
。对研究人员来说,果蝇同时具备的一大优势是,有数不清的遗传学研究工具可以用。
就算你自己生造一种,也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
潮。那么,最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具,操控果蝇的基因
表达,从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例,一个简单地UAS驱动的转基因
,加上时间空间特异性的Gal4 line,就可以非常容易的实现超高的表达量。为了防止
某些同学说太高的表达会杀死细胞,我这里限定只能使用荧光蛋白。因为是外源性的,
一般不大会干扰正常的细胞生理功能。
挑战的方法很简单,我在这里写一个UAS驱动的报告基因,如果你觉得其中哪个部分有
提高的空间,能够让这个转基因的表达量提高,就算挑战成功。
为了不放水,我先写一个我认为的一般强的转基因。如果没有人应答的话,我会在稍后
贴出我认为的最强的设计,包括理由和参考文献。
10X UAS + Hsp70 TATA box (basal promoter) + IVS + eGFP + SV40(3'UTR) |
x********e 发帖数: 35261 | 2 搞那么强做什么呢?
就算gfp没有细胞毒性,高表达会deplete转录翻译一系列的调控因子,照样会有影响
【在 T*****e 的大作中提到】 : 又到周末了,大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多,我在这里抛砖引 : 玉,挑战一下大家。 : 第一次挑战的题目:如何设计果蝇中的最强荧光报告基因? : 简单的背景: : 果蝇作为重要的模式生物,个体小,生长周期短,易于饲养,易于观察,染色体数目少 : ,能吃能睡能学习,各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型 : 。对研究人员来说,果蝇同时具备的一大优势是,有数不清的遗传学研究工具可以用。 : 就算你自己生造一种,也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高 : 潮。那么,最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具,操控果蝇的基因 : 表达,从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例,一个简单地UAS驱动的转基因
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x********e 发帖数: 35261 | 3 另外一个问题是,强UAS能否保证没有leaky expression
【在 T*****e 的大作中提到】 : 又到周末了,大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多,我在这里抛砖引 : 玉,挑战一下大家。 : 第一次挑战的题目:如何设计果蝇中的最强荧光报告基因? : 简单的背景: : 果蝇作为重要的模式生物,个体小,生长周期短,易于饲养,易于观察,染色体数目少 : ,能吃能睡能学习,各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型 : 。对研究人员来说,果蝇同时具备的一大优势是,有数不清的遗传学研究工具可以用。 : 就算你自己生造一种,也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高 : 潮。那么,最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具,操控果蝇的基因 : 表达,从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例,一个简单地UAS驱动的转基因
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s********o 发帖数: 91 | 4 这个和chromosome上insertion的位置也有关系吧,我们lab做过定点(attp/attb)的和
非定点的,定点的表达高至少四倍。insulator应该也有帮助
【在 T*****e 的大作中提到】 : 又到周末了,大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多,我在这里抛砖引 : 玉,挑战一下大家。 : 第一次挑战的题目:如何设计果蝇中的最强荧光报告基因? : 简单的背景: : 果蝇作为重要的模式生物,个体小,生长周期短,易于饲养,易于观察,染色体数目少 : ,能吃能睡能学习,各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型 : 。对研究人员来说,果蝇同时具备的一大优势是,有数不清的遗传学研究工具可以用。 : 就算你自己生造一种,也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高 : 潮。那么,最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具,操控果蝇的基因 : 表达,从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例,一个简单地UAS驱动的转基因
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T*****e 发帖数: 247 | 5 说得好!太强当然可能是有问题的。
姑且不论现在一般并没有半强/强/特强的过表达选择,如果有的话,应该是很有意思的
一件事。
仅就你说的太强的观点,我举个例子。
为了标记神经细胞,很多时候大家会用分布在细胞膜上的荧光蛋白,比如mCD8::GFP。
行业内现在就有一种认识,认为过多的表达这个,对神经细胞的功能可能是有影响的。
而且如果在共用同一个Gal4的情形下,某一个UAS transgene太强,比如40X UAS-CD8:
:GFP可能会因为占用太多的Gal4影响别的transgene表达。
我这个挑战当然不考虑这些因素。主要的原因是实际情况中,有时候Gal4的表达很弱,
又或者不是Gal4-UAS系统,是直接测试enhancer。那么你确实需要一个有很强表达的
transgene。
【在 x********e 的大作中提到】 : 另外一个问题是,强UAS能否保证没有leaky expression
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T*****e 发帖数: 247 | 6 你说的也很好!
我感觉有一种趋势,随机的插入的情形可能会越来越少。
两个原因:
1.随机插入有时候真不好说,可能会破坏不相关的基因功能,当然前辈们也正利用了这
一点。
2.老一点的BAC,以及最近CRISPR,TALEN这些新技术出现后,大家都想精确操控
transgene,一来好定量比较,二来省去很多不相关的来回论证transgene的实验。
我这里默认就是定点插入的。至于插入到哪个位点最高,虽然也有人比较过。但是我不
认为已有定论。
【在 s********o 的大作中提到】 : 这个和chromosome上insertion的位置也有关系吧,我们lab做过定点(attp/attb)的和 : 非定点的,定点的表达高至少四倍。insulator应该也有帮助
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x********e 发帖数: 35261 | 7 那leaky expression的concern就更重要了
hsp算比较强的promoter了,另外Janelia farm用的是一个果蝇的synthetic promoter,
要稍微弱些,但表达更忠实于enhancer的控制
在UAS element上放大信号我不认为是个明智的方法。
GFP。
【在 T*****e 的大作中提到】 : 说得好!太强当然可能是有问题的。 : 姑且不论现在一般并没有半强/强/特强的过表达选择,如果有的话,应该是很有意思的 : 一件事。 : 仅就你说的太强的观点,我举个例子。 : 为了标记神经细胞,很多时候大家会用分布在细胞膜上的荧光蛋白,比如mCD8::GFP。 : 行业内现在就有一种认识,认为过多的表达这个,对神经细胞的功能可能是有影响的。 : 而且如果在共用同一个Gal4的情形下,某一个UAS transgene太强,比如40X UAS-CD8: : :GFP可能会因为占用太多的Gal4影响别的transgene表达。 : 我这个挑战当然不考虑这些因素。主要的原因是实际情况中,有时候Gal4的表达很弱, : 又或者不是Gal4-UAS系统,是直接测试enhancer。那么你确实需要一个有很强表达的
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s*****w 发帖数: 27 | 8 http://www.genetics.org/content/186/2/735.full.pdf
【在 T*****e 的大作中提到】 : 又到周末了,大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多,我在这里抛砖引 : 玉,挑战一下大家。 : 第一次挑战的题目:如何设计果蝇中的最强荧光报告基因? : 简单的背景: : 果蝇作为重要的模式生物,个体小,生长周期短,易于饲养,易于观察,染色体数目少 : ,能吃能睡能学习,各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型 : 。对研究人员来说,果蝇同时具备的一大优势是,有数不清的遗传学研究工具可以用。 : 就算你自己生造一种,也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高 : 潮。那么,最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具,操控果蝇的基因 : 表达,从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例,一个简单地UAS驱动的转基因
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f*******g 发帖数: 245 | 9 UAS-gal 会引出额外的phenotype. 不能再强了。
【在 T*****e 的大作中提到】 : 又到周末了,大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多,我在这里抛砖引 : 玉,挑战一下大家。 : 第一次挑战的题目:如何设计果蝇中的最强荧光报告基因? : 简单的背景: : 果蝇作为重要的模式生物,个体小,生长周期短,易于饲养,易于观察,染色体数目少 : ,能吃能睡能学习,各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型 : 。对研究人员来说,果蝇同时具备的一大优势是,有数不清的遗传学研究工具可以用。 : 就算你自己生造一种,也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高 : 潮。那么,最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具,操控果蝇的基因 : 表达,从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例,一个简单地UAS驱动的转基因
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s********x 发帖数: 472 | 10 看看rubin的pnas,可以提高你的表达量20倍。 |