b***n
发帖数: 36 | 1 请问版上有玩ＧＰＣＲ尤其是dopamine receptor的兄弟姐妹不
我现在在做DR internalization, 试了好几种办法，
不管是Membrane biotinylation,
或者是用Flag M2在没有fix之前去label外膜上的receptor
或者是用Radio ligand来做，
都不是很成功，最近试了一下用Sucrose gradient (35%)来分heavy membrane 和light
vesicle, 应该是有看到了一些internalization.
不过最大的问题是用ＦＬＡＧ Ｍ２做完ＷＢ后看到的并不是一条单一的带，而是一片
的smear,
应该是某些地方没做好，所以Ｄ２Ｒ都聚集了
用的是Biorad的ＳＤＳ loading dye 配方直接溶解膜
或者也试过ＲＩＰＡ和ＴＢＳ＋１０％甘油＋１％triton
效果都不是太好
但是看了不少ｐａｐｅｒ貌似人家都是做得出来了
这个事情搞了大半年，一直没能搞定，老板又特别楞，从来不给些建设性的意见，每隔
一段时间都要威胁一下做不出来就开除，已经被威胁了十数次，真是有点窘境穷途了,,
,,还能不能接着玩生物就在此一举了
版上卧虎藏龙，人才辈出，有没有玩7TM receptor玩得比较遛的达人给些建议，拉小弟
一把
感激不尽，感激不尽
图做得实在优点丑，惭愧了, 图上的是dopamine receptor D2，至于D1的情况会好一点
点， |
e****s
发帖数: 1125 | 2 我没什么经验，瞎扯下，
GPCR glycosylation也会让样品跑成Smear。 有没有报道D2R的glycosylation比较厉害
？ |
n***w
发帖数: 2405 | 3 有什么可以deglycosylation的东西，treat一下试试，看跑起来会不会好点。
【在 e****s 的大作中提到】
: 我没什么经验，瞎扯下，
: GPCR glycosylation也会让样品跑成Smear。 有没有报道D2R的glycosylation比较厉害
: ？
|
u**********d
发帖数: 573 | 4 直接发信问那些做DR的人不知会不会好点
light
【在 b***n 的大作中提到】
: 请问版上有玩ＧＰＣＲ尤其是dopamine receptor的兄弟姐妹不
: 我现在在做DR internalization, 试了好几种办法，
: 不管是Membrane biotinylation,
: 或者是用Flag M2在没有fix之前去label外膜上的receptor
: 或者是用Radio ligand来做，
: 都不是很成功，最近试了一下用Sucrose gradient (35%)来分heavy membrane 和light
: vesicle, 应该是有看到了一些internalization.
: 不过最大的问题是用ＦＬＡＧ Ｍ２做完ＷＢ后看到的并不是一条单一的带，而是一片
: 的smear,
: 应该是某些地方没做好，所以Ｄ２Ｒ都聚集了
|
b******y
发帖数: 627 | 5 What is the upper strong band? |
b***n
发帖数: 36 | 6 谢谢大家的建议，，
看了一些paper，也都是朦朦胧胧的样子，那些条带，glycosylation可能也会是一部分
的问题，不过D1看起来貌似好一些
最大的问题是，我老板不喜欢学生有任何自己的想法，我每次提出要做自己的实验，他
都会鄙视一下，他想做的又没有那么容易做出来，，，，然后现在本来钱就少，想让他
花钱试新东西貌似很苦难。
恩，我回头也发信问问从前的那些作者 |
s*******e
发帖数: 1010 | 7 1.上样前你没把人家给煮了吧？
2.我记得D1R的Flag用M1抗体效果更好
3.买个NEB的PNGaseF吧，没多少钱 |
f*******l
发帖数: 99 | 8 我做过的那个膜蛋白有14个transmembrane domains and several glycosylation
sites,也看到过和你类似的smear.
我用的lysis buffer/IP buffer 是30mM n-Octyl-beta-D glycopyranoside or 10mM
CHAPs buffer,都可以看到清晰的单条带（最常见的glysylated form)
上样前一定不能煮，要用8M Urea buffer RT 处理。 |
b***n
发帖数: 36 | 9 Bearbaby: 上面的那条是分离胶和浓缩胶的分界面，所以是一些不能进入分离胶的聚集
（猜的）
Stilltide: 没有煮，在室温放个三十分钟的样子，，煮了肯定聚集
谢谢Frostall, 我今天就试下你说的条件 |
l**********1
发帖数: 5204 | 10 work 了没? LZ
>谢谢Frostall, 我今天就试下你说的条件
【在 b***n 的大作中提到】
: Bearbaby: 上面的那条是分离胶和浓缩胶的分界面，所以是一些不能进入分离胶的聚集
: （猜的）
: Stilltide: 没有煮，在室温放个三十分钟的样子，，煮了肯定聚集
: 谢谢Frostall, 我今天就试下你说的条件
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i***0
发帖数: 160 | 11 For GPCR internalization, you can try beta-galactosidase complement assay.
search if DiscoverRx has already made the corresponding cell line. That
assay can give you sig/background=10. Internalized GPCR (tagged small
subunit of beta-gal) collocalized with endosome anchored marker protein (
tagged with large subunit of beta-gal) will boost beta-Gal activity. I have
tried this assay. once you have the stable cell line, the protocol is very
simple and the result is very potent. |
b***n
发帖数: 36 | 12 谢谢 lotkaeuler11和ivy00
试了一下，还是没怎么能看到单条带，Chaps放了有将近20年了，估计有点问题
ivy的方法听起来很好，不过我现在可能没有时间set up一个新的方法了
只好硬着头皮解决原来的问题先
再次感谢 |
