r******k
发帖数: 446 | 1 班里有大神做过吗？ 小弟做过两次 基本都是直线呀。。。。。好崩溃！不知道哪里错
了。 细胞前一晚上铺了六万个。 一共四个细胞系。。。都没啥太大反应。。。 |
m******h
发帖数: 38 | 2 是xf24吗？6万细胞很多了，最好上张图。mito test 所用的试剂 oligomycin, FCCP/
CCCP等response 都非常强，没啥反应的话一般是基本试验体系的问题，比如试剂浓度
出现数量及的错误，或者inject 顺序出错，比如你把antimycin/rotenone 加到了A里
面，那么就什么都没有了。注意A/B/C/D的顺序。
【在 r******k 的大作中提到】
: 班里有大神做过吗？ 小弟做过两次 基本都是直线呀。。。。。好崩溃！不知道哪里错
: 了。 细胞前一晚上铺了六万个。 一共四个细胞系。。。都没啥太大反应。。。
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r******g
发帖数: 600 | 3 上原始图～
我应该可以帮你troubleshoot一下 |
L****T
发帖数: 169 | |
A******y
发帖数: 2041 | 5 I think around 150k-200k for the 96 well ones. I could be wrong. Good thing
that I don't have to buy one.
【在 L****T 的大作中提到】
: 搭车问一下：这机器贵么？
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d***s
发帖数: 1062 | 6 感觉这机器稳定性不好？collaborator建议我们每个condition要有10个重复。 |
L****T
发帖数: 169 | 7 好贵！如果不做高通量，有啥替代的选择？
thing
【在 A******y 的大作中提到】
: I think around 150k-200k for the 96 well ones. I could be wrong. Good thing
: that I don't have to buy one.
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g******a
发帖数: 63 | 8 除了一楼回答的原因，还有一个新手容易忽略的事。如果你买的是seahorse自己的mito
stress kit，它里面虽然每种试剂（不同颜色的管子）都有好几管，但是只有盖子上
画了seahorse的那管里面有东西，其他的只是给你分装用的。如果你稀释了空的管子，
当然加进去没反应了。以前别人弄错过。 |
A******y
发帖数: 2041 | 9 Clark electrode!
【在 L****T 的大作中提到】
: 好贵！如果不做高通量，有啥替代的选择？
:
: thing
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r******g
发帖数: 600 | 10 Seahorse XF24 我们这边买的好像是150K
挺贵的
一开始送了很多很多kits,如果自己买挺贵的
这个机器的稳定性非常不好，我一个24 well的plate 只能跑2个sample
意思就是1个sample 11个replicates....
你仔细读paper会发现，很多seahorse data里面给的stats都是+-SEM
你说的那种全部都是直线的情况：
1. 你的medium用的对不对？你用的seahorse自己的mito stress medium还是自己配的
？成分对不对？
2. 你的ABCD孔加对没？ （可能性不大，不然不可能是一直直线）
3. 仔细读manual，inhibitor只有一个瓶子里面有powder，其他的瓶子都是空的
aliqouts，我们一般是180uL DMSO resuspension，然后，分装12个aliquots X 15uL (
kit送6个空瓶子？我们自己再准备6个)
也许你加到ABCD孔里面的全是DMSO，那就没用了
我很不喜欢seahorse这个机器，相当浪费钱和时间... 除非你有非常显著的phenotype
，否则 要花很多时间折腾稳定性的问题 |
r******k
发帖数: 446 | 11 你好
我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系（
我用的mouse ES cell），一样的protocol，什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
。。不知道为什么。。
【在 r******g 的大作中提到】
: Seahorse XF24 我们这边买的好像是150K
: 挺贵的
: 一开始送了很多很多kits,如果自己买挺贵的
: 这个机器的稳定性非常不好，我一个24 well的plate 只能跑2个sample
: 意思就是1个sample 11个replicates....
: 你仔细读paper会发现，很多seahorse data里面给的stats都是+-SEM
: 你说的那种全部都是直线的情况：
: 1. 你的medium用的对不对？你用的seahorse自己的mito stress medium还是自己配的
: ？成分对不对？
: 2. 你的ABCD孔加对没？ （可能性不大，不然不可能是一直直线）
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r******g
发帖数: 600 | 12 在使用各种inhibitor之前要做一个 各种inhibitor concentration的titration assay
你知道吧？
manual里面有
你要optimize你实验各种inhibitor的conc
【在 r******k 的大作中提到】
: 你好
: 我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系（
: 我用的mouse ES cell），一样的protocol，什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
: 。。不知道为什么。。
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A******y
发帖数: 2041 | 13 This just a guess. First, if you baseline OCR is okay, it is likely that
mouse ES cells are more resistant to the inhibitors. A lot of so call stem
cells have their efflux pump at maximum and just pump the inhibitors right
out. That's why they are so hard to kill.
【在 r******k 的大作中提到】
: 你好
: 我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系（
: 我用的mouse ES cell），一样的protocol，什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
: 。。不知道为什么。。
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h*******o
发帖数: 4884 | 14 上个原始图 看看
【在 r******k 的大作中提到】
: 你好
: 我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系（
: 我用的mouse ES cell），一样的protocol，什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
: 。。不知道为什么。。
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