r**a
发帖数: 121 | 1 各位好，
我有一个500bp的片段，要做3X的重复，作为一个大的1500bp的片段，最后放到一个
vector里面去。采用怎样的策略好呢？
一个一个放到vector里；还是弄一个片段，然后让他们自己连接（这样会不会乱连接）
，然后pcr，长度合适的放vector里啊？
谢谢先了！ |
D***a
发帖数: 516 | 2 从一篇文章上抄来的：
cDNA encoding 'artificial' SUMO-2 'polymers' was generated by ligating PCR
products encoding DeltaN11–SUMO-2 while simultaneously digesting with
restriction enzymes specific for BamHI (N-terminal site) and BglII (C-
terminal site) in T4 DNA ligase buffer, 150 mM NaCl, 0.1 mg ml- 1 BSA at 22
°C for 5 h (enzymes and buffers from New England Biolabs). This created a
range of cDNAs encoding DeltaN11–SUMO-2 cDNA 'monomers' and 'multimers'
that were separated by agarose gel electrophoresis and individually
extracted into solution. These were then ligated into the BamHI site in pHis
–TEV plasmid27 which had the EcoRI restriction site mutated into a stop
codon. Expression from these plasmids gives N-terminal 6His-tagged proteins
containing one, two, three or four copies of DeltaN11–SUMO-2. Each SUMO-2 '
monomer' is separated from the other by Arg–Ser, which is also present at
the C-terminus before the stop codon.
【在 r**a 的大作中提到】
: 各位好，
: 我有一个500bp的片段，要做3X的重复，作为一个大的1500bp的片段，最后放到一个
: vector里面去。采用怎样的策略好呢？
: 一个一个放到vector里；还是弄一个片段，然后让他们自己连接（这样会不会乱连接）
: ，然后pcr，长度合适的放vector里啊？
: 谢谢先了！
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b******9
发帖数: 102 | 3 Golden Gate, USER cloning等等 |
j****n
发帖数: 3370 | 4 推荐golden gate
【在 r**a 的大作中提到】
: 各位好，
: 我有一个500bp的片段，要做3X的重复，作为一个大的1500bp的片段，最后放到一个
: vector里面去。采用怎样的策略好呢？
: 一个一个放到vector里；还是弄一个片段，然后让他们自己连接（这样会不会乱连接）
: ，然后pcr，长度合适的放vector里啊？
: 谢谢先了！
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r**a
发帖数: 121 | 5 谢谢啦。我去研究下：）
【在 j****n 的大作中提到】
: 推荐golden gate
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m*****n
发帖数: 760 | 6 请教这个USER cloning相比常规的RE/ligation cloning有什么特别的优势？
【在 b******9 的大作中提到】
: Golden Gate, USER cloning等等
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h**********r
发帖数: 671 | 7 同请教个问题。看网上有人说Gibson assembly有error prone joining，我自己做的时
候好像还好。不知道大家有没有碰到过？ |
s********r
发帖数: 312 | 8 1500bp直接找IDT合成gBlock吧，别折腾了，就2,300块 |
