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p****g
发帖数: 5 | 1 想把ubiquitin通过C端连接到另外一个protein上。把ubiquitin的C端loop最后一个残
基突变成了Cystein，把目标蛋白表面也突变了一个地方成Cysteine。
都是带His-tag，用镍柱纯化，纯化的时候都用了TCEP。到最后把两个蛋白都换进一个
没有还原剂的buffer，然后dialyse 过夜。结果每次都发现cysteine活性很低，只有少
数的目标蛋白连上了ubiquitin。更不解的是ubiquitin自己应该很容易形成di-
ubiquitin，但这个形成的都不多。
各位前辈有没有过这方面的经验，能不能提供一些建议？多谢多谢
（我想到的是Cysteine已经被提前切掉了。或者被氧化成了非二硫键的氧化产物，比如
sulfinic acid...） | v**********m
发帖数: 5516 | 2 先打个质谱看看蛋白质量如何。
目标蛋白和U蛋白的交联反应还要竞争ubiquitin分子间反应，知道反应速度比吗？
提高pH，可以提高二流键的形成反应速度。
【在 p****g 的大作中提到】
: 想把ubiquitin通过C端连接到另外一个protein上。把ubiquitin的C端loop最后一个残
: 基突变成了Cystein，把目标蛋白表面也突变了一个地方成Cysteine。
: 都是带His-tag，用镍柱纯化，纯化的时候都用了TCEP。到最后把两个蛋白都换进一个
: 没有还原剂的buffer，然后dialyse 过夜。结果每次都发现cysteine活性很低，只有少
: 数的目标蛋白连上了ubiquitin。更不解的是ubiquitin自己应该很容易形成di-
: ubiquitin，但这个形成的都不多。
: 各位前辈有没有过这方面的经验，能不能提供一些建议？多谢多谢
: （我想到的是Cysteine已经被提前切掉了。或者被氧化成了非二硫键的氧化产物，比如
: sulfinic acid...）
| z********i
发帖数: 610 | 3 You may have another choice. Sortase
We use this method a lot.
【在 p****g 的大作中提到】
: 想把ubiquitin通过C端连接到另外一个protein上。把ubiquitin的C端loop最后一个残
: 基突变成了Cystein，把目标蛋白表面也突变了一个地方成Cysteine。
: 都是带His-tag，用镍柱纯化，纯化的时候都用了TCEP。到最后把两个蛋白都换进一个
: 没有还原剂的buffer，然后dialyse 过夜。结果每次都发现cysteine活性很低，只有少
: 数的目标蛋白连上了ubiquitin。更不解的是ubiquitin自己应该很容易形成di-
: ubiquitin，但这个形成的都不多。
: 各位前辈有没有过这方面的经验，能不能提供一些建议？多谢多谢
: （我想到的是Cysteine已经被提前切掉了。或者被氧化成了非二硫键的氧化产物，比如
: sulfinic acid...）
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