r**********e
发帖数: 587 | 1 其实是个很基本的问题。
我们一般都用pcr－sanger sequencing来测比如有没有突变，只是看有或者没有
我现在需要知道这个位点的突变的相对精确的allele frequency，比如20% vs 50%的区别
那么我直接sanger sequencing，ab1文件的两种颜色的peak height的差别是否能真实
反映allele frequency的差别呢？ |
r**********e
发帖数: 587 | 2 For example look at the picture below, T vs C, if I see such peak height
ratio
difference, can I claim there's a change for allele frequency?
区别
【在 r**********e 的大作中提到】
: 其实是个很基本的问题。
: 我们一般都用pcr－sanger sequencing来测比如有没有突变，只是看有或者没有
: 我现在需要知道这个位点的突变的相对精确的allele frequency，比如20% vs 50%的区别
: 那么我直接sanger sequencing，ab1文件的两种颜色的peak height的差别是否能真实
: 反映allele frequency的差别呢？
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p**********l
发帖数: 167 | |
r**********e
发帖数: 587 | 4 zhan kai shuoshuo?
【在 p**********l 的大作中提到】
: no
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g***o
发帖数: 92 | 5 Digital PCR is the way to go. Let me know if you need help. |
s*********y
发帖数: 292 | 6 你如果样品少，可以把PCR产物克隆到T载体（或者任何载体）上，然后挑几十个克隆去
测序。这是可以接受的笨方法，至少，bisulfate sequencing之类的东西一直都是这么
做的
当然，只适合少量样品 |
r**********e
发帖数: 587 | 7 很感谢。虽然笨但很好
我就是想问下，如果从最简单最快的pcr sanger sequencing看到差别，那么有多少把
握／信心接下来的精确定量会有显著差别呢？
【在 s*********y 的大作中提到】
: 你如果样品少，可以把PCR产物克隆到T载体（或者任何载体）上，然后挑几十个克隆去
: 测序。这是可以接受的笨方法，至少，bisulfate sequencing之类的东西一直都是这么
: 做的
: 当然，只适合少量样品
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l*****7
发帖数: 8463 | 8 你的DNA原始样品来源是什么？
1 纯的， 单一细胞？ （比如：克隆的纯细胞）
2 多样细胞的混合DNA （比如：血液细胞）
区别
【在 r**********e 的大作中提到】
: 其实是个很基本的问题。
: 我们一般都用pcr－sanger sequencing来测比如有没有突变，只是看有或者没有
: 我现在需要知道这个位点的突变的相对精确的allele frequency，比如20% vs 50%的区别
: 那么我直接sanger sequencing，ab1文件的两种颜色的peak height的差别是否能真实
: 反映allele frequency的差别呢？
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r**********e
发帖数: 587 | 9 单一细胞
genomic DNA from cell lines
【在 l*****7 的大作中提到】
: 你的DNA原始样品来源是什么？
: 1 纯的， 单一细胞？ （比如：克隆的纯细胞）
: 2 多样细胞的混合DNA （比如：血液细胞）
:
: 区别
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l*****7
发帖数: 8463 | 10 1 有不少的细胞线是多克隆的。
2 先做digitalPCR比较省工呀。
【在 r**********e 的大作中提到】
: 单一细胞
: genomic DNA from cell lines
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r**********e
发帖数: 587 | 11 1. Yes many cell lines are multiclonal, that's fine.That's exactly what we
are trying to look at.The percentage of different alleles.
2. Where can I find such service? school core facility?
【在 l*****7 的大作中提到】
: 1 有不少的细胞线是多克隆的。
: 2 先做digitalPCR比较省工呀。
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l*****7
发帖数: 8463 | |
l***y
发帖数: 638 | 13 样品少就克隆测序
样品多或者经常要做的找个有miseq的地方跑一下，便宜的很 |
