c**a
发帖数: 94 | 1 就是Histone acetylation/deacetylation,蛋白放一起做in vitro assay. 有没有什么
trick啊？买来的recombinant protein都不管用，positive control都做不出来。不知
道到底
哪里出了问题。 |
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c********d
发帖数: 118 | 3 跟风问一下
那个商业公司做proteomic assay的口碑比较好？
我要初步检测药物处理后，磷酸化蛋白的变化。
联系了我们学校的proteomic core facility，上次给了他们呢一个样品，1个月也没弄
出个结果
这次打算给公司做，有没有值得推荐的？ |
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b******e
发帖数: 3348 | 4 我也是有这个怀疑，那如果要确认，是不是得做shift assay了？
有没有别的其他实验可以证明的呢？多谢 |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 比如ELISA吧，不是在同一个plate上做的实验，signal不可能保证一致，error
bar都不知怎么做，更无法量化。结果就是只能给出定性的结论，不能给出
XX倍或XX%这种信息。
不知道有没有那种protein assay可以解决这个局限性？
多谢！ |
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m******e
发帖数: 18 | 6 我们以前做的时候是把2个刀片用胶布绑在一起， 在3cm dish 背面划线，十字交叉，
然后种细胞。 100% confluent 后用粗的1000ul的tip头在dish里面划线，这个wound应
该在做的一条平行线记号里。选十字交叉的区域拍照片作为Time0,平行线记号应在照片
上。 每个时间段都选十字交叉的区域拍照片。wound healing定量不太好， transwell
assay 有kit,定量方便。不要用染膜细胞计数的， 有读吸光度的。 |
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z****g
发帖数: 3340 | 7 貌是这个assay variability极大，又是overexpression condition, 一般erro bar 都
超级大，不太reliable.
cell |
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L**********O
发帖数: 1761 | 8 no. Dual Luciferase Assay |
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f**********r
发帖数: 95 | 9 希望是colorimetirc assay，我们没有fluorometer所以不想要荧光的。不知哪家的便
宜又好用？
谢谢！ |
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m**********d
发帖数: 137 | 10 想定量tumor cell里的Reactive oxygen species (ROS)
从invitrogen买的6-carboxy-DCF, 为了确保这个chemical的确能够检测到ROS，首先用
H2O2做了satndard curve：不加DCF,tumor cell有微弱的auto-fluorescence；加DCF的
样品，mean fluorescence intensity（MFI）与H2O2 concentration（0，10，50，100
，500，1000 micro-molar）成线性关系；H2O2 concentration为0的时候，tumor cell
也有较高的endogenous ROS level。整个过程中，对于同一个cell line, FACS的
instrument setting和gating都是一致的。通过这个实验，我觉得比较有把握这个DCF
应该是work了。
然后我给tumor cell不同的treatment和stress，24-72hr,然后用DCF检测细胞内的ROS
水平，之前觉得这些treatment和stress应该up... 阅读全帖 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 11 I don't recommend H2O2, as the reagent itself also elicits DCF fluorescent
signal. Then it will be too hard to distinguish between ROS generated by the cells and ROS attributed to H2O2.
Also, you might want to consider MtSOX for your assay. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 12 H2O2 is also cellular membrane permeable.
Unless you treated cells with H2O2, washed it off and waited for sufficient
amount of time, it is possible that exogenous H2O2 will interfere with your
assay.
I
it
is |
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 想问问看版上做DNA binding protein的同学
有没有简单的方法，不做放射性同位素标记的，Mobility Shift Assay啊？
现在我们手头有一个细菌蛋白
是属于某个细菌细胞器的
该细胞器和DNA无关
但这个蛋白的具体功能未知
只是有不寻常的high pI (>11)
在纯化该蛋白的时候发现UV reading近乎DNA
事实也证明跑胶以后目标蛋白很少
UV reading一多半来自于DNA
过SEC之后能把蛋白和DNA分开
有没有办法做个简单的测试
验证该蛋白能结合DNA？
哪怕是非特异性的 |
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H*g
发帖数: 2333 | 14 Get the sequence of that DNA and then label with biotin
You may try gel shift assay with Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit
from Pierce. |
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m**********2
发帖数: 57 | 16 请问有什么通用或者常规的观察actived JAK/STAT3的functinal assay么?
比如说促进细胞分化之类的? |
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c***c
发帖数: 113 | 17 Hello all.
I will start to do DNA methylation assay, I am totally new to this technique
. Could anyone please tell me which method (or kit) is the most reliable and
currently used one?
Thanks. |
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d****t
发帖数: 139 | 18 3H filter paper binding assay |
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m******5
发帖数: 1383 | 19 问个笼统的问题
在cRNA microarray raw data差别极高的情况下， 如chontrol 10000 treated 30000
这样的数据真实度有多少？在qPCR中能指望看到多少差异？在luciferase promoter
assay中呢？
另外，如果差异是在transient express某个目的基因后得到的，大家通常如何把
transfect efficiency normalize到fold change中呢？直接做乘法？ |
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n******u
发帖数: 418 | 20 以前做luciferase assay
control一般都是b-gal
但是最近新的一批实验发现gal的表达被overexpression的protein repress的很厉害
试过pAct-b gal和pCH110 b gal都是一样的情况
所以问一下，除了用renilla luciferase做control还有其他什么control可以尝试么？ |
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j*****a
发帖数: 92 | 21 如果His tagged protein is present in the soluble fraction是否可以直接做kinetic assay? |
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j*****a
发帖数: 92 | 22 His tagged protein is present in the soluble fraction, 是否可以直接做kinetic
assay? |
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c******6
发帖数: 928 | 23 C12 - Resazurin viability assay.
O'Brien J, Wilson I, Orton T, Pognan F. Investigation of the Alamar Blue (
resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity
. European Journal of Biochemistry. 2000;267:5421-6. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 24 Resazurin assay is usually based on NADH/NADPH, not best applicable for
compounds that interfere with mitochondrial function.
cytotoxicity |
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A******y
发帖数: 2041 | 25 Resazurin, MTT, MTS etc. are all based on mitochondria respiration. If your
cell is attached, I will just do PI stain. You can also count the cell
directly with trypan blue etc.
However, I can tell you the reviewer is been difficult. I bet you already
count the cells and your compounds do inhibits cell growth....I haven't seen
a single compound that could lower the mitochondria function so much that
will affect the MTS assay if it is not directly reflective toward cell
numbers. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 26 3-NPA does that. 3-NPA directly inhibits succinate dehydrogenase activity.
At sub-toxic doses cells are still viable, but SDH activity could be significantly inhibited.
MTT/MTS/Calcein Am/Resazurin assays are often over-used or somewhat used
incorrectly to measure cell viability/cell number.
your
seen |
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r***e
发帖数: 2539 | 27 MTT/MTS/Calcein Am/Resazurin assays are often over-used or somewhat used
能展开说说吗？谢谢！ |
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j******n
发帖数: 941 | 28 SRB assay, very easy to conduct. |
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j****x
发帖数: 1704 | 29 我们用NIH-3T3在nude mice上做in vivo assay。in vitro自然也可以
很难说有best choice，和你蛋白的种类和来源以及下游设计都有关系
of |
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s**********e
发帖数: 2888 | 30 我想问的问题是，这种assay, 是不是给药（putative angiogenesis stimulator/
inhibitor) 只可能加在Matrigel里面？
如果给老鼠注射或者口服药物的话，会不会药物根本不会进入Matrigel,最后看到不到
Matrigel里面的效果？
谢谢了 |
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X******n
发帖数: 24 | 31 想做 PKR in vitro kinase assay, 从没做过这类试验，请帮忙推荐一个好用的 kit.
非常感谢！ |
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X******n
发帖数: 24 | 32 想做 PKR in vitro kinase assay, 从没做过这类试验，请帮忙推荐一个好用的 kit.
非常感谢！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 34 Hello, I have a simple question regarding leukostasis assay.
From the papers I have read and the experience my labmates have, I learned
that they all use Concanavalin A
(conA) to recognize leukostasis and use CD45 to confirm the counting.
But I don't understand why use conA as the particular lectin to do this
experiment?
Is it because the leukocytes express abundant mannosyl or glucosyl sugar
groups that only conA can bind to?
Thanks. |
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F*******2
发帖数: 103 | 35 在bradford protein assay中，先设置一个standard curve, 但是用作standard的蛋白
和需要测的蛋白不是一种蛋白。
那么，我设standard curve （不同蛋白浓度下的595nm Reading）时，浓度单位应该用
mol/L 还是mg/mL? (以便与sample蛋白的595值对比）
感觉应该用mol/L吧，因为sample蛋白和standard蛋白每mg中含的蛋白量不一样啊 |
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g*****n
发帖数: 241 | 36 我觉得我做的一个E3 ubiquitin ligase可能可以ubiquitinate另一个蛋白，想做个In
Vitro Ubiquitin Assay验证一下。但我们实验室不做相关的实验，想找大家推荐一个
性价比比较高的kit。
谢谢 |
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O******e
发帖数: 4845 | 37 由于需要同时检测很多基因，所以需要一个快速但准确度又比较高的cell
proliferation
assay kit。就是想快速地看细胞经过处理后增殖速度的变化。谢谢啦！ |
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h******y
发帖数: 1374 | 38 label retaining assay by FACS |
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s*****t
发帖数: 107 | 39 DNAase I 这个assay的结果好像是要做southern才能知道的把，光看胶好像没用，不说
明问题。 |
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s**********e
发帖数: 2888 | 40 不是直接回答你的问题，我一般是用DAPI染色，然后这样数细胞很清楚。这个assay不
稳定，需要很多次的重复，才可以拿到比较consistent的细胞数目变化的结果。所以，
我估计如果你想进一步作antibody，问题可能更大。
我似乎发现癌细胞还好做一点，primary endothelial cells似乎更难做。
请问能做antibody immunostaining吗？如果可以的话，有详细的protocol可以share吗
？另外如果想收细胞提RNA什么的应该怎么操作呢？ |
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i********g
发帖数: 51 | 41 搜了一下好像没有看到什么好的方法可以用，貌似都是用 soft agar, transformation
assay, xenograft...有大牛了解这个的么？ |
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g**f
发帖数: 50 | 42 做CFU assay，需要数同等数量的bone marrow cells放入dish. 感觉用hemocytometer
数不是很准，请问有没有什么更好的办法？谢谢！ |
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g**f
发帖数: 50 | 43 CASY counter,好主意，长见识了。虽然实验室里没有。请问做CFU assay数细胞数的时
候，你是不是把too small size (debri)和 too large size (aggregation)全部Gate
out, 只算中间部分？谢谢！ |
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b***e
发帖数: 125 | 44 我们在小鼠里敲除一个基因后，做TUNNEL assay,发现retina的inner nuclear layer呈
阳性（上图箭头处），而control则是阴性（下图箭头处）。 但有个同事说是假阳性，
因为真正的阳性细胞应该看上去偏小，呈小点状，而且组织结构应该会mess up,但我这
个retina，看这结构还很完整，不像apoptosis.大家说呢？谢谢。 |
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w*********n
发帖数: 439 | 45 各位大虾，我是新手，正准备开始做拿小鼠T cell作 CHIP assay。
请问你们都是用的那个公司的protein A/G beads？ protein A 和G 该选择那个？
非常感谢~ |
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O******e
发帖数: 4845 | 46 最近一批基因需要做Cell invasion assays，不知道大家一般用哪个公司的？R&D or
Millipore?操作步骤越少越好。价格不是太大的问题。谢谢了！ |
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e****e
发帖数: 1042 | 47 According to your opinion, I should use Bradford assay to determine total
protein and peptide. I will get the total amount of my peptide product from
HPLC. Then the protein amount is total protein and peptide minus the amount
of my peptide product. Dialysis is not necessary, right? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 利用人工智能免疫系 likes CD44 plus Hyaluronan (hyaluronic acid, HA) is a
linear naturally occurring polysaccharide 钓3kDa左右的多肽的鱼
可以不通过分离而直接挑出peptide or protein来特异反应--just matrix two cents.
References:
1)
Erickson M, Stern R.
Chain gangs: new aspects of hyaluronan metabolism.
Biochem Res Int.2012:893947.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22216413
and
2)
Chaim OM et al.(2011)
Brown Spider (Loxosceles genus) Venom Toxins: Tools for Biological Purposes.
Toxins (Basel). 3: 309-344
Abstract
Venomous animals use ... 阅读全帖 |
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y***o
发帖数: 46 | 49 Can anybody recommend a reliable ATP bioluminescence assay kit? Thanks. |
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A******y
发帖数: 2041 | 50 The differences is not at the detection method. The cells grow differently
in cell culture (liquid) verses colongenic method (semi-solid). I can give
you a perfect example which is not reported anywhere. HDAC inhibitor, SAHA,
inhibits leukemia cell growth in cell culture (many papers). However, it
is useless against leukemia growth in colongenic assay. |
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