b******e
发帖数: 3348 | 1 初次做chip assay, 一个疑问，有没有可能pull down 下来的不是transcripition
factor,而是一个和DNA没有直接binding，但是和transcription factor binding 的蛋
白呢，是不是如果要证明这个蛋白就是直接和DNA binding 的，还需要做给shift
assay呢？ |
W****C
发帖数: 1937 | 2 ｃｈｉｐ ａｓｓａｙ测到的不一定是直接ｂｉｎｄ的， ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ把距离
接近的蛋白， 核酸都连在一起了。 我不喜欢这个实验， 背景很高， 结果就是个
ｐｃｒ，作假的太多 |
b******e
发帖数: 3348 | 3 我也是有这个怀疑，那如果要确认，是不是得做shift assay了？
有没有别的其他实验可以证明的呢？多谢
【在 W****C 的大作中提到】
: ｃｈｉｐ ａｓｓａｙ测到的不一定是直接ｂｉｎｄ的， ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ把距离
: 接近的蛋白， 核酸都连在一起了。 我不喜欢这个实验， 背景很高， 结果就是个
: ｐｃｒ，作假的太多
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Z******5
发帖数: 435 | |
F*****e
发帖数: 182 | 5 chip拉下来的实际上应该称为transcriptional complex，可能你的转录因子是直接
binding DNA的，也可能是通过结合其他蛋白一起binding DNA，如果要看直接binding
估计得上gel shift |
b******e
发帖数: 3348 | 6 对，这就是我想要说的，虽然用的primer是locate在有binding site的DNA上的，但也
不能百分百说明是直接binding,
我觉得也得上emsa才能最后证明，
gel shift没做过是不是很难搞，特别是用什么样的buffer做呢？
binding
【在 F*****e 的大作中提到】
: chip拉下来的实际上应该称为transcriptional complex，可能你的转录因子是直接
: binding DNA的，也可能是通过结合其他蛋白一起binding DNA，如果要看直接binding
: 估计得上gel shift
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W****C
发帖数: 1937 | 7 而且分辨率很差， 至少>500bp， 也就是说就是你测到有bind， 这个bind不但可能是
非直接的， 甚至可能都不在你primer的范围内。crosslink大大降低抗体的识别 （即
便多抗也有影响， 说没影响的， 做个WB试试就知道了）， 所以对抗体要求还特别高
（估计要用全长蛋白做的多抗才好一些， 可是现在很多都是用重组肽段做多抗的）。
唯一的好处， 这个算是in vivo， 要是shift assay的话肯定是 in vitro了。 in
vivo的话 应该还可以用luciferase assay + 1.过表达/抑制 TF, 2. 突变/deletion 结合序列 来做， 我倒觉得这个更可
信。 |
F*****e
发帖数: 182 | 8 发paper的话，ChIP加Luciferase就足够了吧，gel shift主要是in vitro的，还是in
vivo的
结果更真实。
高
。
结合
序列 来做， 我倒觉得这个更可
【在 W****C 的大作中提到】
: 而且分辨率很差， 至少>500bp， 也就是说就是你测到有bind， 这个bind不但可能是
: 非直接的， 甚至可能都不在你primer的范围内。crosslink大大降低抗体的识别 （即
: 便多抗也有影响， 说没影响的， 做个WB试试就知道了）， 所以对抗体要求还特别高
: （估计要用全长蛋白做的多抗才好一些， 可是现在很多都是用重组肽段做多抗的）。
: 唯一的好处， 这个算是in vivo， 要是shift assay的话肯定是 in vitro了。 in
: vivo的话 应该还可以用luciferase assay + 1.过表达/抑制 TF, 2. 突变/deletion 结合序列 来做， 我倒觉得这个更可
: 信。
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b******e
发帖数: 3348 | 9 说得很好，多谢！
高
。
结合序列 来做， 我倒觉得这个更可
【在 W****C 的大作中提到】
: 而且分辨率很差， 至少>500bp， 也就是说就是你测到有bind， 这个bind不但可能是
: 非直接的， 甚至可能都不在你primer的范围内。crosslink大大降低抗体的识别 （即
: 便多抗也有影响， 说没影响的， 做个WB试试就知道了）， 所以对抗体要求还特别高
: （估计要用全长蛋白做的多抗才好一些， 可是现在很多都是用重组肽段做多抗的）。
: 唯一的好处， 这个算是in vivo， 要是shift assay的话肯定是 in vitro了。 in
: vivo的话 应该还可以用luciferase assay + 1.过表达/抑制 TF, 2. 突变/deletion 结合序列 来做， 我倒觉得这个更可
: 信。
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W****C
发帖数: 1937 | 10
ChIP的真实只是理想中的事情。。。
【在 F*****e 的大作中提到】
: 发paper的话，ChIP加Luciferase就足够了吧，gel shift主要是in vitro的，还是in
: vivo的
: 结果更真实。
:
: 高
: 。
: 结合
: 序列 来做， 我倒觉得这个更可
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F*****e
发帖数: 182 | 11 ChIP的真实性确实是个问题，特别是ChIP-PCR。 请问目前有没有更好的in vivo的方法
来做
transcription factor和DNA的binding？
【在 W****C 的大作中提到】
:
: ChIP的真实只是理想中的事情。。。
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