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m********2
发帖数: 317 | 2 自己用过几个promoter: CMV, EF1a, SFFV，在干细胞里强弱顺序依此为SFFV>EF1a>CMV.
SFFV最强，但是有时候荧光蛋白或目的基因容易表达过量造成toxic。
问问大家，哪种promoter介于SFFV and EF1a之间?
thank you |
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g*********d
发帖数: 233 | 3 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 4 presumably yes, but you would have to consider half life etc etc etc....BTW,
which vector do you have and how EF1a works in general, what cells are you
working on? I would love to have this one; btw, do you have EF1a with 2A
other than IRES.. |
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d****d
发帖数: 214 | 5 大侠不敢当。
我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
is more consistent among cells in different differentiated status. I use
Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increa... 阅读全帖 |
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d****d
发帖数: 214 | 6 大侠不敢当。
我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
is more consistent among cells in different differentiated status. I use
Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increa... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 顶贴跟车问一下
要稳转一个不带抗性的plasmid到mES cell
请问可以通过共转一个带抗性plasmid的方法来转么？ 做过的同学说一下？ 两个质粒
的ratio要怎么调？经验上两个一起定位到一个的情况多么？ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 12 我用过一个截短的ef1a，大概200bp长，表达量不高但是比较稳定 |
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h******y
发帖数: 1374 | 13 搭车问假设有这样一个构造EF1a-gene X-IRES-DsRed, 理论上讲一个subpopulation的
DsRed荧光越高，那么gene X在这个subpopulation表达也就越高，是吧？ |
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h******y
发帖数: 1374 | 14 Thanks. It is a lentiviral construct made in house
EF1a is a strong promoter....slightly less than CMV though
we have been using it for primary human cells and established cancer cell
lines
no 2A as the linker
BTW,
you |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 right. EF1a is better than CMV
and 2A is better than IRES considering you can always get robust expression
of the later gene
..
for |
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n********k
发帖数: 2818 | 16 purpose? I think EF1a is likely one of the best for stem cells... |
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s******r
发帖数: 2876 | 17 普通的cell Line中表达，不一定是stem cell，就是想知道有没有比较versatile的。
EF1a是个strong promoter，有没有不那么强的，表达低一点的。 |
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d****d
发帖数: 214 | 18 试试EF1a promoter吧，绝对比CMV及retrovirus自身的promoter强很多，而且受细胞的
分化状态影响小。
我用的就是retrovirus vector，如果用reporter gene 如GFP,CD90来检测的话，感染
率都在90%以上。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 19 Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
，反之则可以。 |
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d****d
发帖数: 214 | 20 Oh, I replaced the CMV promoter in pQCXIN with the EF1a promoter by myself.
If you check the systembio website, you may find they already have something
similar. |
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d****d
发帖数: 214 | 21 试试EF1a promoter吧，绝对比CMV及retrovirus自身的promoter强很多，而且受细胞的
分化状态影响小。
我用的就是retrovirus vector，如果用reporter gene 如GFP,CD90来检测的话，感染
率都在90%以上。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 22 Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
，反之则可以。 |
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d****d
发帖数: 214 | 23 Oh, I replaced the CMV promoter in pQCXIN with the EF1a promoter by myself.
If you check the systembio website, you may find they already have something
similar. |
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s******s
发帖数: 13035 | 24 CMV其实很烂，很多细胞里面会被repress。
还不如搞个中等表达的ef1a一类的 |
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s*****i
发帖数: 315 | 26 CAGGS/EF1a/Cbh/Ubi promoter + lox-stop-lox + transgene
用tissue specific Cre
tissue |
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a*******a
发帖数: 4233 | 27 我不确定，不排除这个可能
我用pcdna3.1接6k多带n端和c端tag的tet1
转染後用if检测，只有不超过2%的细胞是阳性，换过ubc ef1a启动子都没什么改善。还
做过几个类似大小的蛋白都是类似现象。
但是转9k的lv载体加3k的蛋白再加1.5k的ires gfp，蛋白表达的就很好。排除质粒太大
转染效率不高的可能。
后来我的解决办法是不做这么大的基因了。 |
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W*P
发帖数: 14 | 28 一直以来对在ES cell表达蛋白很头痛，总是很难达到理想的表达水平。请教版上有经
验的牛人们是用什么promoter或vector来表达蛋白的？EF1a promoter会不会比较好？
用lentivirus会比plasmid好吗？
在此先谢过各位！祝大家假期愉快！ |
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l***y
发帖数: 638 | 30 promoter用EF1a别用CMV系列，lenti表达个RFP十代没问题。silencing没办法就是快点
慢点，gene有功能的影响细胞会丢得更快，隔几代用puro重筛一下
colonies
有3 |
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f*******e
发帖数: 354 | 31 不要用mscv，cmv这些常规retrovirus的promoter，很快会被silence，可以用plenti，
psin，phage等，ef1a, cag, pgk可以坚持一段时间，但是也存在被silence等现象.转
质粒总体比较困难，病毒是最高效的方法。在细胞传代的同时加lentivirus，
polybrene，然后spin半小时，效率会很高. rock inhibitor记得加，不然细胞会死光
光.病毒含血清的话几个小时后就可以换掉，如果要drug selection，过夜也没事，第
二天可以继续加rock inhibitor，浓度可以降到5um。
good luck！
: 非常感谢！我好好读下pMSCV retroviruses的manual。你觉得用pCDH是因为这些
: transgene被silenced吗？还是有其他的原因？非常非常感谢！
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发帖数: 1 | 32 非常感谢。我用的pCDH是EF1a promoter，就是越往后传代，colonies数量越少。我把
细胞一直养在含puro的hESC media里。非常感谢你的帮助。 |
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发帖数: 1 | 33 要在MEFs细胞里用lentivirus表达基因。看到有文章说CMV启动子在MEFs细胞中会被沉
默掉，效率不高。请问各位老师有相关经验吗？我是否应该选择用EF1a启动子在MEFs细
胞里表达基因更好？ |
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