m*****u
发帖数: 15526 | 1 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？ |
s********n
发帖数: 248 | |
m*****u
发帖数: 15526 | 3 不是cell line，就是primary cell
【在 s********n 的大作中提到】
: 那个cell line？
|
g***u
发帖数: 33 | 4 我们在human原代CD4是用lenti，HIV derived系统，能到15-20%吧。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
: 高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？
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m*****u
发帖数: 15526 | 5 这个不高吧？human和mouse细胞promoter activity是有差别的。比如CMV在mouse细胞
就表达低。不知道哪个能表达高点？
【在 g***u 的大作中提到】
: 我们在human原代CD4是用lenti，HIV derived系统，能到15-20%吧。
|
d****d
发帖数: 214 | 6 试试EF1a promoter吧，绝对比CMV及retrovirus自身的promoter强很多，而且受细胞的
分化状态影响小。
我用的就是retrovirus vector，如果用reporter gene 如GFP,CD90来检测的话，感染
率都在90%以上。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 这个不高吧？human和mouse细胞promoter activity是有差别的。比如CMV在mouse细胞
: 就表达低。不知道哪个能表达高点？
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s*****i
发帖数: 315 | 7 Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
，反之则可以。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
: 高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？
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m*****u
发帖数: 15526 | 8 谢谢大侠。能否提供进一步信息？用的哪个retroviral vector？用什么包装细胞系？
用不用PCL－Eco之类helper plasmid？
【在 d****d 的大作中提到】
: 试试EF1a promoter吧，绝对比CMV及retrovirus自身的promoter强很多，而且受细胞的
: 分化状态影响小。
: 我用的就是retrovirus vector，如果用reporter gene 如GFP,CD90来检测的话，感染
: 率都在90%以上。
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a******s
发帖数: 37 | 9 MSCV vector, packaging plasmid PCL-ECO
【在 m*****u 的大作中提到】
: 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
: 高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？
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m*****u
发帖数: 15526 | 10 看过这个。介绍说是在stem cell里work，不知道T细胞怎么样？谢谢
【在 a******s 的大作中提到】
: MSCV vector, packaging plasmid PCL-ECO
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d****d
发帖数: 214 | 11 大侠不敢当。
我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
is more consistent among cells in different differentiated status. I use
Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increase transduction efficiency for several folds.
You may also find this webpage useful: http://systembio.com/lentiviral-technology/expression-vectors/cdna/overview
【在 m*****u 的大作中提到】
: 谢谢大侠。能否提供进一步信息？用的哪个retroviral vector？用什么包装细胞系？
: 用不用PCL－Eco之类helper plasmid？
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a******s
发帖数: 37 | 12 transduction efficiency 10-50% (pMIT or pMIG). T cells need to be activated
before transduction.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 看过这个。介绍说是在stem cell里work，不知道T细胞怎么样？谢谢
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m*****u
发帖数: 15526 | 13 谢谢详细解答。查了一下PQCXIN。也是CMV promoter。不知道你说的EF-1a promoter在
哪里？
based
promoter
【在 d****d 的大作中提到】
: 大侠不敢当。
: 我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
: Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
: sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
: on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
: is more consistent among cells in different differentiated status. I use
: Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increase transduction efficiency for several folds.
: You may also find this webpage useful: http://systembio.com/lentiviral-technology/expression-vectors/cdna/overview
|
d****d
发帖数: 214 | 14 Oh, I replaced the CMV promoter in pQCXIN with the EF1a promoter by myself.
If you check the systembio website, you may find they already have something
similar.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 谢谢详细解答。查了一下PQCXIN。也是CMV promoter。不知道你说的EF-1a promoter在
: 哪里？
:
: based
: promoter
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m*****u
发帖数: 15526 | 15 没找到retroviral vector.都是lentiviral vector.用lenti的话转染效率跟retro比哪
个高？对T细胞而言
.
something
【在 d****d 的大作中提到】
: Oh, I replaced the CMV promoter in pQCXIN with the EF1a promoter by myself.
: If you check the systembio website, you may find they already have something
: similar.
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d****d
发帖数: 214 | 16 I have not used lentiviral vector before, so I cannot comment on that. But
as I said, I can get over 90% transduction efficiency using the pMSCV vector
to express just one cDNA. When I use 2A strategy to express two or three
cDNAs, then I can get 50% transduction efficiency, which should be
acceptable for many applications.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 没找到retroviral vector.都是lentiviral vector.用lenti的话转染效率跟retro比哪
: 个高？对T细胞而言
:
: .
: something
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s********n
发帖数: 248 | 17 RE!
【在 s*****i 的大作中提到】
: Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
: 对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
: ，反之则可以。
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m*****u
发帖数: 15526 | 18 再请教一下，从哪里order MSCV-IRES-Thy1.1？我查了一下addgene有MSCV-IRES-Thy1.
1 DEST for gateway cloning，不过是attB site，觉得比较奇怪。attB site是不能和
pEntr vector recombination的
based
promoter
【在 d****d 的大作中提到】
: 大侠不敢当。
: 我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
: Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
: sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
: on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
: is more consistent among cells in different differentiated status. I use
: Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increase transduction efficiency for several folds.
: You may also find this webpage useful: http://systembio.com/lentiviral-technology/expression-vectors/cdna/overview
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d****d
发帖数: 214 | 19 I got it from another lab in the same university. The one I got is probably
of the original version, with no attB site.
Thy1.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 再请教一下，从哪里order MSCV-IRES-Thy1.1？我查了一下addgene有MSCV-IRES-Thy1.
: 1 DEST for gateway cloning，不过是attB site，觉得比较奇怪。attB site是不能和
: pEntr vector recombination的
:
: based
: promoter
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m*****u
发帖数: 15526 | 20 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？ |
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s********n
发帖数: 248 | |
m*****u
发帖数: 15526 | 22 不是cell line，就是primary cell
【在 s********n 的大作中提到】
: 那个cell line？
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g***u
发帖数: 33 | 23 我们在human原代CD4是用lenti，HIV derived系统，能到15-20%吧。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
: 高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？
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m*****u
发帖数: 15526 | 24 这个不高吧？human和mouse细胞promoter activity是有差别的。比如CMV在mouse细胞
就表达低。不知道哪个能表达高点？
【在 g***u 的大作中提到】
: 我们在human原代CD4是用lenti，HIV derived系统，能到15-20%吧。
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d****d
发帖数: 214 | 25 试试EF1a promoter吧，绝对比CMV及retrovirus自身的promoter强很多，而且受细胞的
分化状态影响小。
我用的就是retrovirus vector，如果用reporter gene 如GFP,CD90来检测的话，感染
率都在90%以上。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 这个不高吧？human和mouse细胞promoter activity是有差别的。比如CMV在mouse细胞
: 就表达低。不知道哪个能表达高点？
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s*****i
发帖数: 315 | 26 Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
，反之则可以。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
: 高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？
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m*****u
发帖数: 15526 | 27 谢谢大侠。能否提供进一步信息？用的哪个retroviral vector？用什么包装细胞系？
用不用PCL－Eco之类helper plasmid？
【在 d****d 的大作中提到】
: 试试EF1a promoter吧，绝对比CMV及retrovirus自身的promoter强很多，而且受细胞的
: 分化状态影响小。
: 我用的就是retrovirus vector，如果用reporter gene 如GFP,CD90来检测的话，感染
: 率都在90%以上。
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a******s
发帖数: 37 | 28 MSCV vector, packaging plasmid PCL-ECO
【在 m*****u 的大作中提到】
: 需要稳定整合。该选lenti还是retrovirus系统？选什么promoter在小鼠T细胞里面表达
: 高？望做过的大虾们不吝赐教。包子酬谢？
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m*****u
发帖数: 15526 | 29 看过这个。介绍说是在stem cell里work，不知道T细胞怎么样？谢谢
【在 a******s 的大作中提到】
: MSCV vector, packaging plasmid PCL-ECO
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d****d
发帖数: 214 | 30 大侠不敢当。
我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
is more consistent among cells in different differentiated status. I use
Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increase transduction efficiency for several folds.
You may also find this webpage useful: http://systembio.com/lentiviral-technology/expression-vectors/cdna/overview
【在 m*****u 的大作中提到】
: 谢谢大侠。能否提供进一步信息？用的哪个retroviral vector？用什么包装细胞系？
: 用不用PCL－Eco之类helper plasmid？
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a******s
发帖数: 37 | 31 transduction efficiency 10-50% (pMIT or pMIG). T cells need to be activated
before transduction.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 看过这个。介绍说是在stem cell里work，不知道T细胞怎么样？谢谢
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m*****u
发帖数: 15526 | 32 谢谢详细解答。查了一下PQCXIN。也是CMV promoter。不知道你说的EF-1a promoter在
哪里？
based
promoter
【在 d****d 的大作中提到】
: 大侠不敢当。
: 我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
: Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
: sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
: on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
: is more consistent among cells in different differentiated status. I use
: Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increase transduction efficiency for several folds.
: You may also find this webpage useful: http://systembio.com/lentiviral-technology/expression-vectors/cdna/overview
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d****d
发帖数: 214 | 33 Oh, I replaced the CMV promoter in pQCXIN with the EF1a promoter by myself.
If you check the systembio website, you may find they already have something
similar.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 谢谢详细解答。查了一下PQCXIN。也是CMV promoter。不知道你说的EF-1a promoter在
: 哪里？
:
: based
: promoter
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m*****u
发帖数: 15526 | 34 没找到retroviral vector.都是lentiviral vector.用lenti的话转染效率跟retro比哪
个高？对T细胞而言
.
something
【在 d****d 的大作中提到】
: Oh, I replaced the CMV promoter in pQCXIN with the EF1a promoter by myself.
: If you check the systembio website, you may find they already have something
: similar.
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d****d
发帖数: 214 | 35 I have not used lentiviral vector before, so I cannot comment on that. But
as I said, I can get over 90% transduction efficiency using the pMSCV vector
to express just one cDNA. When I use 2A strategy to express two or three
cDNAs, then I can get 50% transduction efficiency, which should be
acceptable for many applications.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 没找到retroviral vector.都是lentiviral vector.用lenti的话转染效率跟retro比哪
: 个高？对T细胞而言
:
: .
: something
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s********n
发帖数: 248 | 36 RE!
【在 s*****i 的大作中提到】
: Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
: 对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
: ，反之则可以。
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m*****u
发帖数: 15526 | 37 再请教一下，从哪里order MSCV-IRES-Thy1.1？我查了一下addgene有MSCV-IRES-Thy1.
1 DEST for gateway cloning，不过是attB site，觉得比较奇怪。attB site是不能和
pEntr vector recombination的
based
promoter
【在 d****d 的大作中提到】
: 大侠不敢当。
: 我用的vectors主要是两种，一种是MSCV-IRES-Thy1.1 (pMIT)，一种是pQCXIN (from
: Clontech, but with EF1a promoter inserted downstream of the packaging
: sequence.The pMIT vector is already good enough for T cell expression based
: on my own experience. But the expression with the vectors with EF1a promoter
: is more consistent among cells in different differentiated status. I use
: Phoenix cell line http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html for packaging, and found helper plasmid DNA can increase transduction efficiency for several folds.
: You may also find this webpage useful: http://systembio.com/lentiviral-technology/expression-vectors/cdna/overview
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d****d
发帖数: 214 | 38 I got it from another lab in the same university. The one I got is probably
of the original version, with no attB site.
Thy1.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 再请教一下，从哪里order MSCV-IRES-Thy1.1？我查了一下addgene有MSCV-IRES-Thy1.
: 1 DEST for gateway cloning，不过是attB site，觉得比较奇怪。attB site是不能和
: pEntr vector recombination的
:
: based
: promoter
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x**********8
发帖数: 3151 | 39 LZ对中国人特别仇视， 大家不要回答他
【在 m*****u 的大作中提到】
: 再请教一下，从哪里order MSCV-IRES-Thy1.1？我查了一下addgene有MSCV-IRES-Thy1.
: 1 DEST for gateway cloning，不过是attB site，觉得比较奇怪。attB site是不能和
: pEntr vector recombination的
:
: based
: promoter
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