s******y
发帖数: 28562 | 1 今天下午我正好在做 Lentivirus 所以再多嘴说两句吧。
我说上面某几位同学啊，如果你们自己没有亲自做过这个Lentivirus，最好也
去查查google 看看这个病毒是干什么的好不好？如果实在看不懂英文的话，
去百度查查慢病毒，然后再来发言行不行？我很怀疑某些同学是不是一看到
“病毒”这个关键词就立刻跳了起来发言的？
我这里不是说lentivirus 绝对安全什么什么的，但是这个东西首先是风险很小。
至少在美国，到目前为止没有任何一例被实验室里的lentivirus 感染的病例。因为这
个东西其实是一个假病毒，它用的蛋白外壳和里面的酶都是人为拼凑出来的，就是故意
让它不能复制而设计的。即使不小心滴在皮肤上，它也是不能感染角质层的细胞的。唯
一的有可能感染人体的风险，就是被滴进眼睛里或者被针头插到自己了。在这个情况下
，也顶多就是你身上某些细胞会被转染上它携带的蛋白，但是不会出现这个病毒在你身
上大肆复制的情况（我已经说了，这个病毒在正常情况下是不能复制的）。在这个情况
下面，就看这个蛋白到底是什么蛋白了。如果是个强致癌蛋白就有点麻烦，但也主要是
对操作人员有麻烦，并不涉及胎儿... 阅读全帖 |
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m**1
发帖数: 2 | 2 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
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b******k
发帖数: 2321 | 3 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: bookmark (hahaha), 信区: Biology
标 题: 怀孕期间做lentivirus要紧么？
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 23 17:23:55 2010, 美东)
刚发现自己怀孕了 可是下个月本来计划要做一些lentivirus的实验 请问lentivirus对
孕妇/孩子有影响么。。那murine retrovirus呢？google了还没查到 谢谢啦 |
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m***9
发帖数: 30 | 4 马上做实验要接触lentivirus了，有点怕怕的。上来问一下大侠们lentivirus发生重组
产生有复制能力的病毒的机率有多大啊？我们用的是二代的lentivirus。谢谢大家啦。 |
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P******r
发帖数: 11 | 5 我的理解Lentivirus 是慢的，不会很快见到GFP。摘自维基百科：
Lentivirus (lenti-, Latin for "slow") is a genus of slow viruses of the
Retroviridae family, characterized by a long incubation period. Lentiviruses
can deliver a significant amount of genetic information into the DNA of the
host cell and have the unique ability among retroviruses of being able to
replicate in non-dividing cells。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 6 大量制备高纯度的lentivirus----你制备的是溶液还是可以吸入的颗粒? 如果是可以
吸入的可能需要更小心.
lentivirus应该是proliferation defect的, 但如果你做的lentivirus表达Kras, 如果
你把它注射到你的手上, 说不定会感染的那一块会长cancer
总体来说还是比较安全的, 按照BSL-2+ 做就可以了. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 What are lentiviral vectors?
Lentiviral vectors are a type of retrovirus that can infect both
dividing and nondividing cells because their preintegration complex (virus
“shell”) can get through the intact membrane of the nucleus of the target
cell. Lentiviruses can be used to provide highly effective gene therapy as
lentiviruses can change the expression of their target cell's gene for up to
six months. They can be used for nondividing or terminally differentiated
cells such as neurons, ma... 阅读全帖 |
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w*****a
发帖数: 437 | 8 刚接触Lentivirus，啥都不懂，求大拿指点。
是这样，老板想看一个基因A在Smooth muscle cell differentiation里面的作用。手
上有个神经干细胞的cell line，加Tgfb后5-6天会变成SMC。
然后有前人留下来的overexpression A的lentivirus，和knockdown A的ShRNA
lentivirus，冻在-80,都大概有10多管15ml的virus。
老板想用virus overexpress 或 knockdown 基因A, 然后看differentiation pattern
有啥变化。可能用qPCR，RNA-seq啥的做readout。
本来想随便测个titer，把现有的virus加1ml到正differentiate的细胞里面（24 well)
，然后提个RNA就得了。后来一想，问题来了：
1）这神经干细胞特金贵，要特殊的medium养才成，我这virus supernatant加进去搞个
几天，还能活吗？更不提按正常程序differentiate了。那做出来的东西，不是非常的
artificial么？
2)... 阅读全帖 |
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E*********4
发帖数: 16 | 9 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA ta... 阅读全帖 |
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K*o
发帖数: 96 | 10 我正在做Lentivirus，但是在Packaging的时候总是遇到问题。我用的是CellBio Labs
公司的Plat-A细胞，他们公司介绍上说是Stably expressing packaging gene的293细
胞。
我的做法是：第一天把细胞种上。第二天早上细胞贴壁贴的很好，然后转染，我直接把
Fugene和DNA的mix加到Media里。第三天早上换新鲜的Media。问题是我每次
Transfection以后，第二天这些细胞都会漂起来。看上去那些细胞并没死，但是就黏在
一起然后漂在Media里。几次了都这样。转染3天后，我把所有的液体收集起来后离心，
然后用上清infect breast cancer cells，效果很差。我觉得应该是Transfection的问
题。版上有人碰过类此的问题么？这到底是怎么回事呀？为什么我的细胞总是转染后漂
起来呢？平常传代的时候它们看着都挺正常的。
有没有其他的办法？或者大家用什么细胞或Reagent做Lentivirus Packaging效果好的
，分享一下？ |
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h********n
发帖数: 4079 | 11 lentivirus construct 上两个LTR之间的长度是不是有上限? 好像是8K?
我手头这个construct一共13.3Kb, 其中5'LTR -- sin LTR有7.5Kb, 有没有可能插入一
个2K的promoter+gene?
做lentivirus的高人请指教一下,
谢谢 |
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b******k
发帖数: 2321 | 12 刚发现自己怀孕了 可是下个月本来计划要做一些lentivirus的实验 请问lentivirus对
孕妇/孩子有影响么。。那murine retrovirus呢？google了还没查到 谢谢啦 |
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r******m
发帖数: 10 | 13 在一个生物物理实验室， 要用lentivirus transfect neurons。实验室以前也没有别
人做过。
看看biosafety的描述，很危险的样子。
问一下有经验的同学，用lentivirus是不是真的很危险，要注意些什么？ |
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S******e
发帖数: 393 | 14 250kD 估计到了lentivirus 的极限了， 我曾经考虑做更大的蛋白，
但看了说明好像lentivirus 包装有个极限，所以就没做，
若之后你发现250kD可以表达很好，吱一声，我下次也试试。 |
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W**S
发帖数: 275 | 15 今天悲摧了，generate了一批LENTIVIRUS，结果PURO SELECT之后CELL都死了，这次着
急，没做MIDI PREP，直接用MINIPREP的PLASMID做的TRANSFECTION, PLASMID的质量不
是太好，浓度很低，260/230不太好，同一批用MIDIPREP GENERATE的VIRUS没问题。请
问LENTIVIRUS不WORK会是因为PLASMID的质量不好吗？以前也用MINIPREP的PLASMID做过
，没问题。多谢！ |
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a****d
发帖数: 1919 | 16 You don't have to use polybrene for lentivirus transduction in primary
neuronal culture. If you concentrate the lentivirus, make sure to spin down
the undissolved pellet after re-suspending the viral particle. The
undissolved pellet could be toxic for cells too. |
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a****l
发帖数: 125 | 17 大鸟 mentioned that lentivirus cannot get access to G0 cells. But what are
the stages of those non-dividing cells such as neurons, macrophages,
hematopoietic stem cells, retinal photoreceptors, and muscle and liver cells?
有人用lentivirus 做 tail vein injection 去infect liver 吗？ |
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B****n
发帖数: 22 | 18 the cell survived your selection. so your lentivirus works fine.
you may extract the DNA from the infected cell to see if your cDNA is still
there or not.
If i remember correctly, when you transfected 293T cells, the region between
the 2 LTR region will be transcribed and spliced. when the lentivirus
infects cells, the virus genome(RNA) will be retrotranscribed into DNA and
integrated into genome. So if there is any intron or intron like structure
in your contruct, it maybe processed as an intro... 阅读全帖 |
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h******t
发帖数: 56 | 19 我先用的是pEN-TmiRC3 entry vector和pslik-Neo 目的质粒，效率非常低。
后来试用了pWPI vector, 在addgene就有，效率就非常高了，但是pWPI vector是第二
代 lentivirus vector,我就没有继续使用了。所以我也不能完全确定的说是因为LR
reaction造成了问题还是因为第二代lentivirus因为有更多的HIV gene,所以效率更高
。希望你的试验能给个更conclusive的答案。 |
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h******t
发帖数: 56 | 20 又来问问题了。VSV可以aerosol传播，那VSVG包裹的lentivirus呢？传播途径和包裹蛋
白有关系吗？
还有就是HIV在空气中很不稳定，但是VSVG包裹的lentivirus会不会延长virus在空气中
的存活时间呢？ |
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l******g
发帖数: 1145 | 21 50aa的tag的话，直接挂引物上有点太大了，我没有试过。
你要加的tag如果已经在其他质粒里的话，要么直接切，要么pcr带酶切位点扩增出来后
，先subcloning到lentivirus的表达载体里，一事两便，靠近5’和3’的msc各做一个
。5’的那个记得要有start codon。这两个质粒，以后可以用来放其他要tag的蛋白。
在克隆好带tag的lentivirus质粒后，再用pcr带酶切位点扩增你的目标蛋白，然后
subcloning进去。
注意：
1.在5’加tag的话，如果有现成酶切位点可以利用的话，可以直接subclone，不用pcr
的话，可以减少mutation的几率。
2. 3’加tag，扩增目标蛋白时，记得把stop codon去掉。
3.设计流程时，千万注意最后蛋白和tag是in frame的（连在后面的那个）！！ |
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a*********n
发帖数: 2526 | 22 想用lentivirus作knockdown, 不知道有多危险，据说lentivirus可以转染皮肤上的细
胞致癌，尤其是转染一些oncogene. |
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d**********t
发帖数: 20415 | 23 多谢回复~
这个蛋白的表达没有问题，我们用 transient expression和现有的lentivirus都表达
过，只是现有的lentivirus vector没有selection marker,没法筛稳定表达克隆，所以
想找一个带select marker的vector
请问你用的是哪个vector和package system?
colony |
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a*******a
发帖数: 4233 | 24 我觉得各个公司的载体大同小异。
关于lentivirus载体有一点心得供你参考
以前用过好几种lentivirus，
一种是inder verma实验室的cscg， backbone里面只有必须元件，
还有一个是不知道哪里来的载体，里面加了很多提高包装/表达效率的元件，比如WPRE
之类现在的商业化载体大多是这种结构。
转小蛋白及gfp，第二种载体表达量、转染率都要远远高于cscg
但是转130k的雄激素受体AR的时候， cscg转的细胞的表达量是后者的十倍以上
我觉得转大基因最关键的是要尽量cut 两个ltr之间的长度。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 25 其实我是急着加 4-OHT, 又怕影响lentivirus的感染.
4-OHT会影响lentivirus的效率吗? |
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j******i
发帖数: 939 | 26 5个小时足够lentivirus进入细胞了 一般半个小时就可以看到virus进入细胞了 不确定
最快多久能整合到基因组里 lentivirus还有个reverse transcription的过程 如果4-
OHT不是逆转录抑制剂的话 5个小时没有问题 你有lv-gfp做control的话 可以知道到底
有没有影响转录和插入了 |
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h********n
发帖数: 4079 | 27 其实我是急着加 4-OHT, 又怕影响lentivirus的感染.
4-OHT会影响lentivirus的效率吗? |
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j******i
发帖数: 939 | 28 5个小时足够lentivirus进入细胞了 一般半个小时就可以看到virus进入细胞了 不确定
最快多久能整合到基因组里 lentivirus还有个reverse transcription的过程 如果4-
OHT不是逆转录抑制剂的话 5个小时没有问题 你有lv-gfp做control的话 可以知道到底
有没有影响转录和插入了 |
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a********a
发帖数: 428 | 29 有没有同学遇到shrna包装成lentivirus后，不能knock down targeted protein了、、
没有包装成lentivirus之前，kd效果还不错。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 其实lentivirus 是相当安全的一个工具。除非是转一些比较麻烦的基因（比方说另外
一个网友说的强致癌基因才需要注意一点）。
而且这种东西，用酒精一搽就失活了，远远比放射性什么的好处理得多。要注意的事项
其实都很简单：
1。一定要穿长裤，袜子以及完全覆盖脚的鞋子。
2。一定要戴手套
3。一定要戴护目镜
4。预先准备好酒精和diluted bleach,
5. 如果要用到针头，一定要注意处理，一定要用sharp box 并把针头直接丢进去，绝
对不可以试图把用过的针头放回那个塑料套里。
我知道你一向喜欢在这里劝退什么的，我对此一向都不反对，我甚至有时候还赞成。但
是你要是没有处理lentivirus实际经验的话,麻烦不要说这种话来吓别人。你要注意你
说的这种夸张的话弄不好会导致对方和老板大闹而失业什么的。当然你可能会说，生物
本来就不应该做，失业就失业吧。但是别人可能会有别人的顾虑，未必就那么的乐意失
业。而且仅仅是为了一些不值得去大闹的事情而去大闹的话，会burn her bridge。我
们作为科学工作者，应该尽可能的告诉别人自己知道的事实和真相，让别人去做自己的
决定，最好不要... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 你忘了一点，楼主如果不去做lentivirus, 就必然会被去安排做其他事情（除非她转行
不干生物了）。而我上面已经说过了，相对于其他事情，其实lentivirus的风险是更容
易控制的。
我也知道不应该鼓励他人去吸烟，但是万一某人必须在吸烟和吸毒之间选择呢？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 唉。。。我知道怀孕的时候大家担心是有原因的，但是我上面说的很明白了，我不是说
不需要小心，而是这个lentivirus 其实比生物实验室里面的很多东西都安全得多。至
少，你说的那个博士如果不是做化学而是做lentivirus的，几乎是不可能出现吃了块饼
干就中毒的事情的。因为这种假病毒什么的，一碰到胃酸就灭活了。即使万一真的吃了
进去也不会导致截肢啊植物人啊这么可怕的后果。而从你举的那个例子，更是。。。怎
么说呢？孕妇连饼干都不要吃了？
算了，我也不多说了。说多了弄不好会让大家误会。
Semina
来, |
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m**1
发帖数: 2 | 33 因为Lentivirus感染U2OS cells的效率高，~ 98%; 而Fugene转染效率为~70%.因为我最
后的实验要用FACS来做，所以我希望几乎所有的细胞多能感染。 |
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D***a
发帖数: 516 | 34 用293T细胞，转lentivirus病毒载体和gagpal+vsvg,产生的病毒是不是有一部分又感染
回到293T了？那这个会增加病毒产率（比如说感染回去，vector又可以被复制，产生新
的病毒）还是降低病毒产率（病毒被消耗掉了）？
我的一个shRNA病毒产量总是很低（一个是共转染之后293T荧光少（载体含GFP），另一
个是病毒infect target cell后筛选，得到的克隆少得多），跟control和另外一个
gene family isoform相比。我做了不加gagpal和vsvg,把载体单独转到293T里面，从
GFP荧光看plasmid质量没问题，跟control是一样的。查到有文章提到这个蛋白可以帮
助病毒entry，是不是就是病毒低的原因呢？
谢谢大家。 |
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y*********r
发帖数: 78 | 35 想用openbiosystems 的shRNAmir(lentivirus) 的高效价病毒转染T cell去knock down
一个基因， 可是只有50ul病毒.担心实验不工作， 把病毒浪费了。 哪位有经验的告
诉一个work 的protocol. 谢了。 |
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l**********n
发帖数: 240 | 36 细胞膜带负电荷，影响病毒颗粒附着。
polybrene 带正电荷能中和部分细胞膜的电荷，因而能facilitate particle
attachment.
我用lentivirus， （with polybrene）在人血管平滑肌细胞达到70％感染率(assessed
by puromycin resistence)，在大鼠细胞达到30%. |
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a******n
发帖数: 392 | 37 哪篇文献说过人胚胎干细胞lentivirus transduction的效率问题? 谢了！ |
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B******o
发帖数: 496 | 38 pubmed上有不少啊。不过需要注意的是，你的lentiviral vector的promoter最好是EF1
或者PGK的，CMV之类的promoter在hES会被silence掉。所以如果你看到某篇文献用CMV
之类的vector然后讨论说MOI多少的时候效率有多高，基本是忽悠。据俺所致，比如像
su-chun zhang的lab用lentivirus还是需要有建立稳定细胞系的过程
另外，如果要enhance transduction, 除了polybrene，可以再加上spinoculation |
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d****i
发帖数: 2346 | 39 你说的promoter的问题有没有参考文献？
我用lentivirus做overexpression怎么都做不出来。但是把plasmid直接转到细胞里面
却可以检测到蛋白的overexpression。
我用的就是CMV promoter。
谢谢！
EF1
CMV |
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h**********8
发帖数: 650 | 40 Biomicro is right.
The purpose of Lentivirus is to get stable transfected cell line
Ordinary plasmid can get hight expression but is transient.
CMV promoter is virus promoter, cells can silcent it. I get this information
from my boss, but I have not found this paper. |
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d****i
发帖数: 2346 | 41 非常感谢！
1）现在知道的CMV promoter都在哪些细胞系里面会被silenced？
2）另外，这种silence是CMV promoter自身的问题还是lentivirus的问题？是不是在retrovirus载体里也存在这种现象？ |
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j*****5
发帖数: 24 | 43 i am trying to making a SHRNA lentivirus vector ( pRNAT from Gene script),
however, i was unable to get positive clone, And the yield of the plasmid
is also very low ( around 200ng/ul) I used HB101 E.coli competent cells,
Anybody can help me out? Thanks in advance. |
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r******d
发帖数: 24 | 44 病毒制备与浓缩是转染的关键。我一般是用10cm plate转染后12小时换液，48后收
virus（10ml)。浓缩可用clontech. Lentivirus Concentrator。
祝好运。 |
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c********o
发帖数: 135 | 45 I heard that mouse ES cells are hard to be infected by lentivirus. |
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K*o
发帖数: 96 | 46 可我有时候没换，他们也浮起来了。这是不是很不正常？
你也是用293细胞么？我看到有些公司卖专门用来Packaging Lentivirus 的细胞，广告
上倒是写的不错，但也不知道到底好不好用。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 47 我也不确定那个比较有效果，所以我想同时加进去，会不会效果更好点?
同一个细胞会不会同时感染三个不同的lentivirus？
谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 48 其实都是同一个基因的设计的3哥不同的lentivirus啊，
如果哪个基因有表型，我再分开分析就可以了吧？ |
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r******m
发帖数: 10 | 49 Thank you!
那用lentivirus transfect 过的细胞的培养液危险吗？Image细胞的时候有时候会洒到
外面又不知道。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 50 6K的基因 能用lentivirus包装，感染HL60悬浮细胞系么？
前面试过电转，筛不到阳性。或者有没有人试过6K的基因电转到HL60细胞系？ |
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