A******y
发帖数: 2041 | 1 Polybrene warns not to used on primary neurons. Do spin transduction maybe? |
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L*******e
发帖数: 2153 | 2 what is spin transduction? SORRY, I AM SO DUMB.
maybe? |
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j****x
发帖数: 1704 | 3 如果是这种情况，那自然没啥好说的，降低polybrene的比例甚至完全不加，很多情况
下一样可以感染只是效率降低，我对primary neuro cell不熟，但是在primary
hepatocyte上，spin infection效果还不错
only
So |
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L*******e
发帖数: 2153 | 4 Do you mean that I should add the virus directly?
down |
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L*******e
发帖数: 2153 | 5 what is spin infection? Do you mind sending me your protocol? Thanks! |
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j****x
发帖数: 1704 | 6 很简单，就是染毒后细胞培养板在2000rpm（800g？）32度/37度下离心1-2小时，具体
的条件参数根据不用的细胞可能需要调整 |
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L*******e
发帖数: 2153 | 7 with polybrene? or without? I checked some websites, most people still use
polybrene. Do you use it in your case? I guess 1 or 2 hrs incubation of
polybrene is not as toxic as overnight? |
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j****x
发帖数: 1704 | 8 without，因为之后并不换液啊。对你的情况先尝试不加polybrene吧，效率可能会降低
，但因为毒性问题也不得不这么尝试一下，没准运气好。假如效率显著降低没法用，就
再试试spin infection with polybrene，然后孵育4-6小时再换液，这样比过夜强点 |
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L*******e
发帖数: 2153 | 9 Thanks SO MUCH. You have been very helpful. Good luck with your experiments/
career. I will update you later. : ) |
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a****d
发帖数: 1919 | 10 That's what I normally do with primary neuronal cells (10 MOI). |
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g*********5
发帖数: 2533 | 11 like me ask some lentivirus vector to overexpess,
because no commercial availlable now.
some ppl have this plasmid,
i wrote to him, but not reply...
I bought vetor from invitrogen, no work :( |
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g*********5
发帖数: 2533 | 12 1. not big issue.
2. usually I put it 18-24 hours with polybrene. and some protocol said if
polybrene toxic, try 6 hour? |
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r***e
发帖数: 2539 | 13 病毒吸附到细胞上很快，半个小时就够了。当然做实验的时候没人这么快就换液的。 |
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f*******e
发帖数: 354 | 16 re, retrovirus can only infect dividing cells. but LV is specie and cell cyc
le independent. |
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t****g
发帖数: 120 | 17 谢谢楼上的回复！ 每次做病毒的实验都是有些战战兢兢的。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 18 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 19 为什么要钙转？效率低。
换mirus Transit LT1。
openbiosystem 有protocol |
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b**********8
发帖数: 349 | 20 谢谢楼上，终于等到回复了
鉴于我帖子中描述的这个protocol已经是我师姐建立的很成熟的方法，不过在我这里遇
到了一些问题，所以我更期待针对这些问题的意见和建议，目前暂不考虑更换protocol
，谢谢啦 |
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b**********8
发帖数: 349 | 22
是一样的，我们一直使用的sigma 的 PLKO.1-puro-shRNA 质粒，我现在每次都是从师
姐留给我的那管质粒中取一点出来做转化然后midiprep。 |
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d*p
发帖数: 534 | 23 然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。
48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上，看起来阳性，实际不是。 |
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D***y
发帖数: 693 | 25 addgene有个lentivirus based载体：FUW-SOKM ，是Rudolf Jaenisch实验室的。 |
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p********e
发帖数: 61 | 26 看了大家的回帖，很受感动。大家确实给了很多宝贵意见（只有一个例外）。总结一下
大家的意见和我的想法。
1. 如何真正实现供货，后勤，销售和市场营销等
这个我确实考虑了很多。我觉得基本上都搞定了。不过我还没有正是开始，不知道到时
会不会有新的问题产生。有一位有经验的大哥告诉我：遇到问题学会去解决就是了，你
们做科研难道不是每天都在解决新问题吗？我觉得这位大哥很在理，也很感激他。
2. 中国进货质量
生物试剂和电子产品一样，其实大多数都是中国生产。只不过贴了Invitrogen, Sigma
之类的标而已。我要做的都不是什么前沿试剂，都是常用的试剂，制造方法十分成熟。
比如单克隆抗体，Marker, Plasmid kit等，能有什么质量问题？大家去查一查AbCam的
单抗，看一看TDS,你会发现很多都与国内的某些小公司一模一样，原因在于它们来自于
国内的公司，只不过贴了AbCam的标而已。
关键还是在于我们对供货商的质控。我其实已经有很多供货商了。我本人以及一些朋友
正在做测试。如果过关我们才会贴到我网站上。（这就是为什么我网站上只有产品类别
而暂时还没有产品的原因）
不过如... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 27
多谢回复，两个抗体都是购自于Upstate公司，他们公司卖这两个抗体已经很久了。WB
出来的size大小也都一致。所以我觉得抗体应该没问题。
另外，mRNA水平确实有非常明显的降低，infection shRNA lentivirus之后72小时就能
看到大约80%的降低。
欢迎更多的讨论。 |
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o**i
发帖数: 1165 | 28 293 cells stop proliferating upon plasmid transfection.
the effect of shRNA of any kinds should be minimal. |
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B******o
发帖数: 496 | 31 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。 |
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s******o
发帖数: 187 | 33 Thank you for the information.
I saw too that before posting my question here. I am kind of looking for a
lentiviral cloning vector that carries SV40 then I can package my own virus
particles |
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m*****n
发帖数: 760 | 37 1. 感染细胞时，在genome上插入1个还是多个copies？
2. 这个插入位点是比较特异的还是随机的？ |
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j******1
发帖数: 1315 | 39 包Lentivirus，但是如果用来感染Stem cell血清会对Stem Cell 有影响吧？才想到，
各位大侠该怎么办？ |
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o*****l
发帖数: 172 | 40 好像lipofectamine之类的在HL-1上效率比较低，最好要用lentivirus
据说HL-1要建stable cell line很困难，也许这也是用的人少的原因之一把。。。。 |
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t******y
发帖数: 716 | 41 实验中需要用到把原代细胞永生化。不知道有哪位朋友能够提供永生化效率比较高的质
粒或lentivirus。
还有一个问题：永生化质粒表达的蛋白，有些是肿瘤基因，有些是端粒酶，有的是表达
细胞周期的蛋白。有谁知道这些不同的蛋白表达对细胞有何影响。譬如，如果我需要原
代细胞保持分化潜力，希望基因组能够保持稳定，不形成染色体变异，应该选择哪些质
粒？
谢谢 |
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w******n
发帖数: 767 | 42 这么简单的东西，哪家公司都行吧。话说，我就会做。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 43 当然你会做, 可是我没法给你钱.
我需要用在老鼠上, 要用很多, 所以需要确定一个公司, 有稳定的QC. |
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m**********d
发帖数: 137 | 45 in vitro用luciferase标记肿瘤细胞，打入体内，用bioluminescence和PET/CT跟踪肿
瘤生长和转移
有个很基本的问题没搞明白，我查看实验室前人的notebook发现他当年用transient
transfection转染了一个表达luciferase的plasmid进去，用puromycin筛选一段时间，
就打进老鼠里去了，我在想他为啥不用lentivirus来做stable cell，像他那样做的
transient transfection随着肿瘤细胞的不断分裂岂不是早被dilute了，就算在in
vitro一直有puromycin的selection pressure，那达到体内之后呢？总之觉得不大靠谱
，可那位前辈已经离开了lab，所以来这里请教请教
多谢 |
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B***e
发帖数: 46 | 46 doxycycline inducible lentivirus is a good choice.. |
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B***e
发帖数: 46 | 47 doxycycline inducible lentivirus is a good choice.. |
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F*K
发帖数: 608 | 48 follow your old protocol, and do it again.
second
ml
selection |
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G******7
发帖数: 1352 | 49 puromycin加太早了，感染2-3天后再筛选
second
ml
selection |
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m*****u
发帖数: 15526 | 50 看infect啥细胞了。跟cell cycle有很大关系。肿瘤细胞很快，原代就慢。记得用GFP infect原代骨髓细胞，4,5天镜下才能看出绿来
second
ml
selection |
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