c**a
发帖数: 94 | 1 以前没有用过昆虫细胞,现在需要从SF9 细胞里表达蛋白并纯化. 之前试着用
lipofectamine
tranfect细胞, 没有收集到多少蛋白. 请求有经验的高手给个protocol或者方法,用什
么transfection
reagent比较好. 怎么lyse和纯化蛋白. 谢谢了. |
J********n
发帖数: 534 | 2 这个不用transfection reagent。
需要先制备P3 virus (就是P1 amplify三次)，sf9 cells很容易break，比E.coli更简
单。之后最好ultracentrifuge 40K, 1hour.
要更具体的，上invitrogen或者BD Biosciences看看。他们产生P1 virus所用方法不同。
当然，比较新的BacMam就更简单了。 |
n******d
发帖数: 1055 | |
c**a
发帖数: 94 | 4 要用virus吗, 我们现在没有任何virus系统,只能做transfection
同。
【在 J********n 的大作中提到】
: 这个不用transfection reagent。
: 需要先制备P3 virus (就是P1 amplify三次)，sf9 cells很容易break，比E.coli更简
: 单。之后最好ultracentrifuge 40K, 1hour.
: 要更具体的，上invitrogen或者BD Biosciences看看。他们产生P1 virus所用方法不同。
: 当然，比较新的BacMam就更简单了。
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a*****n
发帖数: 2835 | 5 transfection用293T吧
sf9是做病毒比较好
【在 c**a 的大作中提到】
: 要用virus吗, 我们现在没有任何virus系统,只能做transfection
:
: 同。
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c**a
发帖数: 94 | 6 是, 但如果 不得不在 sf9 上做transfection呢, 有没有好的建议啊
【在 a*****n 的大作中提到】
: transfection用293T吧
: sf9是做病毒比较好
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s*******r
发帖数: 562 | |
a******n
发帖数: 167 | 8 先克隆到bac-to-bac里面，用DH10Bac制作bacmid，用Cellfectin吧bacmid转进sf9，获
得P1 virus，然后amplify到P3。
P1和P2不是不可以用，只是titer很低。直接large scale结果相当烂。
P3收集多了，测过titer不错之后，可以用作seed做large scale（试过roller bottle
啥的，200mL）。
看似前期麻烦，但是比死命转不进去强多了。 |
