e*******e
发帖数: 342 | 1 最近很是郁闷！本来很是简单的His融合蛋白纯化总是做不出来，不知怎么搞的，无论
是从Sf9细胞表达的蛋白还是E. coli表达的蛋白，蛋白总是洗脱不下来。蛋白上柱时是
在Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+50 mM Imidazole (pH 7.0)的体系中，洗
脱时我用的是Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+200 mM Imidazole (pH 7.0)，
结果蛋白还是结合在Beads上。请问有没有遇到类似情况而又解决掉的？ |
I*****y
发帖数: 6402 | 2 increase imidazole concentration, and pH to 8.0
【在 e*******e 的大作中提到】
: 最近很是郁闷！本来很是简单的His融合蛋白纯化总是做不出来，不知怎么搞的，无论
: 是从Sf9细胞表达的蛋白还是E. coli表达的蛋白，蛋白总是洗脱不下来。蛋白上柱时是
: 在Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+50 mM Imidazole (pH 7.0)的体系中，洗
: 脱时我用的是Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+200 mM Imidazole (pH 7.0)，
: 结果蛋白还是结合在Beads上。请问有没有遇到类似情况而又解决掉的？
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b******n
发帖数: 4225 | 3 是沉淀在柱子上吧
你可以用点尿素洗脱试试
【在 e*******e 的大作中提到】
: 最近很是郁闷！本来很是简单的His融合蛋白纯化总是做不出来，不知怎么搞的，无论
: 是从Sf9细胞表达的蛋白还是E. coli表达的蛋白，蛋白总是洗脱不下来。蛋白上柱时是
: 在Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+50 mM Imidazole (pH 7.0)的体系中，洗
: 脱时我用的是Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+200 mM Imidazole (pH 7.0)，
: 结果蛋白还是结合在Beads上。请问有没有遇到类似情况而又解决掉的？
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I*****y
发帖数: 6402 | 4 这个有点危险吧，如果LZ还要活性的话
【在 b******n 的大作中提到】
: 是沉淀在柱子上吧
: 你可以用点尿素洗脱试试
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j*****n
发帖数: 217 | |
V********n
发帖数: 305 | 6 Imidazole浓度不够。用到1M（或者0.5M？总之200 mM 是不够的），应该能下来。俺之
前遇到过类似情况。 |
e*******e
发帖数: 342 | 7 是啊，后面还要做功能实验
【在 I*****y 的大作中提到】
: 这个有点危险吧，如果LZ还要活性的话
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e*******e
发帖数: 342 | 8 不过，我看troubleshooting上讲降低pH可提高洗脱效率
【在 I*****y 的大作中提到】
: increase imidazole concentration, and pH to 8.0
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s*******e
发帖数: 1010 | 9 u can use cobalt beads instead of Ni -- Co has lower His-affinity than Ni |
l****y
发帖数: 398 | 10 EDTA
【在 e*******e 的大作中提到】
: 最近很是郁闷！本来很是简单的His融合蛋白纯化总是做不出来，不知怎么搞的，无论
: 是从Sf9细胞表达的蛋白还是E. coli表达的蛋白，蛋白总是洗脱不下来。蛋白上柱时是
: 在Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+50 mM Imidazole (pH 7.0)的体系中，洗
: 脱时我用的是Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+200 mM Imidazole (pH 7.0)，
: 结果蛋白还是结合在Beads上。请问有没有遇到类似情况而又解决掉的？
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