r******t
发帖数: 629 | 1 嗯，制备级别的。
看着好多，不知道哪种比较好呢？
鞠躬，谢谢大家！ |
s********n
发帖数: 2939 | |
L*****t
发帖数: 56 | 3 制备级别其实都差不多，国产的NiNTA用一两次效果不错但是再生后效率下降。Qiagen
的IDA树脂还有Clonetech的那个专有填料都还可以。不差钱就直接买GE的HisTrap(
NiNMPNBTA)或者Chelating Sepharose (IDA）。 |
s*******e
发帖数: 1010 | 4 Talon背景干净，但是钴的亲和性低于镍。
Qiagen的NTA亲和能力强，但是杂带也会多一些。 |
o*****r
发帖数: 156 | 5 Qiagen NTA, add 10-25 mM imidazole in the sample and buffer to reduce non-
specific binding
【在 s*******e 的大作中提到】
: Talon背景干净，但是钴的亲和性低于镍。
: Qiagen的NTA亲和能力强，但是杂带也会多一些。
|
s*******e
发帖数: 1010 | 6 still worse background than Talon.
【在 o*****r 的大作中提到】
: Qiagen NTA, add 10-25 mM imidazole in the sample and buffer to reduce non-
: specific binding
|
j******3
发帖数: 5244 | 7 。。。。。
我的经验正好相反
GE的非常干净
talon一堆堆的杂带
【在 s*******e 的大作中提到】
: Talon背景干净，但是钴的亲和性低于镍。
: Qiagen的NTA亲和能力强，但是杂带也会多一些。
|
C*******e
发帖数: 4348 | 8 +1
talon对有的his-tag蛋白不错
惊艳
有的就很烂很烂，杂带多，目标蛋白得率也低
不如Ni的对不同蛋白的performance相对稳定
【在 j******3 的大作中提到】
: 。。。。。
: 我的经验正好相反
: GE的非常干净
: talon一堆堆的杂带
|
j******3
发帖数: 5244 | 9 而且talon还有个问题就是optimize起来比较困难
洗脱液浓度范围不如ni大
梯度拉不开
【在 C*******e 的大作中提到】
: +1
: talon对有的his-tag蛋白不错
: 惊艳
: 有的就很烂很烂，杂带多，目标蛋白得率也低
: 不如Ni的对不同蛋白的performance相对稳定
|
C*******e
发帖数: 4348 | 10 是滴
所以现在我还是换回用ni柱
【在 j******3 的大作中提到】
: 而且talon还有个问题就是optimize起来比较困难
: 洗脱液浓度范围不如ni大
: 梯度拉不开
|
|
|
s********n
发帖数: 2939 | 11 不知道LZ的制备级是指多大量？其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
我以前一直是GE的忠实用户，整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了，他
家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns，nickle和cobalt都有，都很方便。最大
的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg，Co柱子能到
30 mg.Co柱子非常好，我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶，全部成功。 |
c*********r
发帖数: 1312 | |
z*********8
发帖数: 1203 | 13
特別同意這個，我覺得talon特別好用，純化後跑膠太乾淨了。
【在 s*******e 的大作中提到】
: Talon背景干净，但是钴的亲和性低于镍。
: Qiagen的NTA亲和能力强，但是杂带也会多一些。
|
s*******e
发帖数: 1010 | 14 从上面回复看得出来，提蛋白这个事儿真的是千江有水千江月 |
V**3
发帖数: 12756 | 15 用centrifuged column 你无法用buffer gradient吧？
莫非就来几个step 就完了？
【在 s********n 的大作中提到】
: 不知道LZ的制备级是指多大量？其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
: 我以前一直是GE的忠实用户，整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了，他
: 家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns，nickle和cobalt都有，都很方便。最大
: 的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg，Co柱子能到
: 30 mg.Co柱子非常好，我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶，全部成功。
|
r******t
发帖数: 629 | 16
嗯，mg级别，不需要做结晶那么多，nmr量足矣。
不过就是要纯。
另外是否那种spin column 不太容易弄得很纯？
【在 s********n 的大作中提到】
: 不知道LZ的制备级是指多大量？其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
: 我以前一直是GE的忠实用户，整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了，他
: 家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns，nickle和cobalt都有，都很方便。最大
: 的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg，Co柱子能到
: 30 mg.Co柱子非常好，我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶，全部成功。
|
r******t
发帖数: 629 | 17
请问怎么optimize条件啊？
汗，啥叫梯度拉不开？
另外就是一般重力过柱子，还是灌柱后用fplc？
【在 j******3 的大作中提到】
: 而且talon还有个问题就是optimize起来比较困难
: 洗脱液浓度范围不如ni大
: 梯度拉不开
|
s********n
发帖数: 2939 | 18 难道你觉得做结晶的不需要很纯？
【在 r******t 的大作中提到】
:
: 请问怎么optimize条件啊？
: 汗，啥叫梯度拉不开？
: 另外就是一般重力过柱子，还是灌柱后用fplc？
|
s*******e
发帖数: 1010 | 19 不需要，真的不需要 >80%就可以了
【在 s********n 的大作中提到】
: 难道你觉得做结晶的不需要很纯？
|
s********n
发帖数: 2939 | 20 OK，那是你的经验。
我是一定要>90%的
【在 s*******e 的大作中提到】
: 不需要，真的不需要 >80%就可以了
|
|
|
s*******e
发帖数: 1010 | 21 真的是一个蛋白一个样，我有纯到逆天就是不长晶体的，也有边elute边出沉淀结果能
过1.5A的。
【在 s********n 的大作中提到】
: OK，那是你的经验。
: 我是一定要>90%的
|
p********e
发帖数: 61 | 22 Macherey-Nagel(Qiagen和Clontech的核酸纯化技术均来自该公司）也进入了His-tag纯
化领域。他们提供不同亲和力的镍柱：Ni-IDA, Ni-NTA, Ni-TED。介质可以选择Silica
或Agarose.Silica Resin的结合非特异蛋白要比琼脂糖少很多。有AKTA兼容的标准1ml
和5ml柱，也有靠重力自主驱动的柱子。质量很好，价格比GE要低不少。大家可以从MN
直接买：http://www.mn-net.com/Products/Proteinpurification/PurificationofHistagproteins/tabid/1448/language/en-US/Default.aspx
也可以从我这里买，享受15％折扣。如果需要免费样品一试，我们很乐意提供。到我们
的网站给我们发信。
http://www.speedbiosystems.com/Protino_Products.aspx |
s*******e
发帖数: 1010 | 23 你们在Fisher里面吗？
Silica
1ml
MN
【在 p********e 的大作中提到】
: Macherey-Nagel(Qiagen和Clontech的核酸纯化技术均来自该公司）也进入了His-tag纯
: 化领域。他们提供不同亲和力的镍柱：Ni-IDA, Ni-NTA, Ni-TED。介质可以选择Silica
: 或Agarose.Silica Resin的结合非特异蛋白要比琼脂糖少很多。有AKTA兼容的标准1ml
: 和5ml柱，也有靠重力自主驱动的柱子。质量很好，价格比GE要低不少。大家可以从MN
: 直接买：http://www.mn-net.com/Products/Proteinpurification/PurificationofHistagproteins/tabid/1448/language/en-US/Default.aspx
: 也可以从我这里买，享受15％折扣。如果需要免费样品一试，我们很乐意提供。到我们
: 的网站给我们发信。
: http://www.speedbiosystems.com/Protino_Products.aspx
|
j******3
发帖数: 5244 | 24 一个是binding时候里面imidazole的浓度
洗脱的时候从binding浓度洗脱，50往上做梯度，直到500
然后page，看哪些浓度出来条带
收集洗脱液，浓缩
【在 r******t 的大作中提到】
:
: 请问怎么optimize条件啊？
: 汗，啥叫梯度拉不开？
: 另外就是一般重力过柱子，还是灌柱后用fplc？
|
p********e
发帖数: 61 | 25
不在。我们本身就是一个小一些的Fisher。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 你们在Fisher里面吗？
:
: Silica
: 1ml
: MN
|
s********n
发帖数: 2939 | 26 你这些都是普遍情况？个例拿出来说没有什么意思。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 真的是一个蛋白一个样，我有纯到逆天就是不长晶体的，也有边elute边出沉淀结果能
: 过1.5A的。
|
L*****t
发帖数: 56 | 27 我习惯用IDA挂Zn纯化His，果然是少数派么。
一次纯化多个蛋白其实也不一定要用spin column, 用Pharmacia P-3之类的三道蠕动泵
也可以 |
s*******e
发帖数: 1010 | 28 话是没错，可是在这个领域面前，谁手里的情况又不是个例呢？不积累个例又怎么能知
道普遍情况呢？
【在 s********n 的大作中提到】
: 你这些都是普遍情况？个例拿出来说没有什么意思。
|
C*******e
发帖数: 4348 | 29 ＋1
所以说蛋白结晶这个事情不是个science而是"art"捏
【在 s*******e 的大作中提到】
: 真的是一个蛋白一个样，我有纯到逆天就是不长晶体的，也有边elute边出沉淀结果能
: 过1.5A的。
|
r******t
发帖数: 629 | 30 谢谢指导，我再问一下：
请问可以recover这个柱子吗？还是一次性的？
貌似这pierce的柱子不便宜啊～～～
【在 s********n 的大作中提到】
: 不知道LZ的制备级是指多大量？其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
: 我以前一直是GE的忠实用户，整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了，他
: 家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns，nickle和cobalt都有，都很方便。最大
: 的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg，Co柱子能到
: 30 mg.Co柱子非常好，我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶，全部成功。
|
|
|
s********n
发帖数: 2939 | 31 这些柱子都是可以regenerate的，你可以看看manual，里面建议是用low pH（5.0），
我觉得也可以用EDTA然后recharge。不过我一般都是一个柱子用在同一个蛋白上。
价格我没有比较所以不是很清楚，不过很方便，看你如何取舍了。如果你需要的量不大
，可以试试1 ml的，纯化个十几mg应该没问题。
GE还有一种柱子是gravity的，也很方便，可以同时操作几个柱子，好像效果也不错，
不过估计也不便宜。
【在 r******t 的大作中提到】
: 谢谢指导，我再问一下：
: 请问可以recover这个柱子吗？还是一次性的？
: 貌似这pierce的柱子不便宜啊～～～
|
s********n
发帖数: 2939 | 32 所以要看普遍情况，大部分成功的例子都是纯度比较高（>90%）,当然的说的例子我也
听说过，所以一般而言纯度是必要而非充分条件。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 话是没错，可是在这个领域面前，谁手里的情况又不是个例呢？不积累个例又怎么能知
: 道普遍情况呢？
|
s******r
发帖数: 2876 | 33 搭车问问，现在纯化这种重组蛋白，是不是一步就能到90%纯。
所以要看普遍情况，大部分成功的例子都是纯度比较高（>90%）,当然的说的例子我也
听说过，所以一般而言纯度是必要而非充分条件。
【在 s********n 的大作中提到】
: 所以要看普遍情况，大部分成功的例子都是纯度比较高（>90%）,当然的说的例子我也
: 听说过，所以一般而言纯度是必要而非充分条件。
|
s*******e
发帖数: 1010 | 34 说句玩笑话，这个问题的答案永远是case by case。如果你的蛋白表达量很高（>mg/
Liter）是有可能的，但是一般都需要在亲和洗脱后加一步分子筛或离子交换进一步纯
化一下才能达到90%。如果你在蛋白质和亲和标签之间加了特异性蛋白酶（TEV，
FactorXa之类的）位点的话，可以考虑上柱之后用蛋白酶切下蛋白而非洗脱，这种情况
一般比洗脱得到的蛋白纯度高（因为相当于针对标签和酶切识别序列进行了双重纯化）
，但要小心有的蛋白结合亲和柱后对蛋白酶有抗性的情况。
【在 s******r 的大作中提到】
: 搭车问问，现在纯化这种重组蛋白，是不是一步就能到90%纯。
:
: 所以要看普遍情况，大部分成功的例子都是纯度比较高（>90%）,当然的说的例子我也
: 听说过，所以一般而言纯度是必要而非充分条件。
|
s********n
发帖数: 2939 | 35 LS基本上已经回答你了。
我的经验（5个不同蛋白，都是N-terminal 6xHis tag）是通过Co-NTA spin columns一
步就得到>90%的蛋白（当然还要做buffer exchange），其中一些蛋白Ni-NTA也行。你
可以试试，但不能保证在你的蛋白上也一定work。
【在 s******r 的大作中提到】
: 搭车问问，现在纯化这种重组蛋白，是不是一步就能到90%纯。
:
: 所以要看普遍情况，大部分成功的例子都是纯度比较高（>90%）,当然的说的例子我也
: 听说过，所以一般而言纯度是必要而非充分条件。
|
