H*g
发帖数: 2333 | 1 准备用纯化的his-tag蛋白做EMSA，不知道imidazole会不会对EMSA有很大影响。
请教大家，需要事先脱盐除掉imidazole(300mM)吗？不知道要不要老板去买desalting
的柱子。
Thanks！ |
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k****k
发帖数: 36 | 2 提纯蛋白，头一步用含有imidazole的buffer从NI-NTA column洗脱。用FPLC Q column
再次纯化之后，发现仍有imidazole残存。有人遇到过同样情况么？应如何解决？谢谢
。 |
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g*********3
发帖数: 177 | 3 最近在做蛋白纯化，用的zymogen his6 column，elution完后，用SDS-LB煮了5分分钟
，发现western有若干条带。
实验室的人说是imidazole会降解蛋白。在网上查也有不少人说imidazole会降解蛋白。
请问各位是否遇到这样的问题。
谢谢。 |
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g*********3
发帖数: 177 | 4 谢谢。网上说的倒不是imidazole会降解蛋白，而是imidazole在高温和SDS-LB煮的时候
会降解蛋白。问了周围的人，他们一般都dialysis。不知道synbio79有没有啥好推荐的
dialysis kit。
谢谢。 |
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a***n
发帖数: 578 | 5 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区,原文如下 】
发信人: argon (哼,看怎样整你), 信区: Chemistry
标 题: Imidazole 的N上保护集团如何去掉?
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri Apr 1 08:34:27 2005) WWW-POST
在设计一反应.
用CH3保护IMIDAZOLE上的N
反应完后不知道该怎样去掉.
郁闷...
哪位大虾赐教一二.先谢了. |
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I*****y
发帖数: 6402 | 6 在我以前用过的系统里面，300 mM imidazole影响EMSA的binding, oligomerization
desalting |
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a********n
发帖数: 844 | 7 建议拿到蛋白后直接做个EMSA试一试能不能。dialysis几步下来蛋白损失，活性可能受
影响，如果EMSA不被imidazole影响，就可以省去dialysis这个麻烦。 |
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c******o
发帖数: 63 | 8 好怪的问题，你怎么知道imidazole还有残存？ |
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s******9
发帖数: 283 | 9 没见过imidazole降解蛋白。要排除在细胞内就降解了（或者修饰变大了），或者抗体
有问题。 |
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a***n
发帖数: 578 | 10 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区,原文如下 】
发信人: argon (argon), 信区: Chemistry
标 题: Another question: mechanism of oxidation of imidazole?
发信站: The unknown SPACE (Mon Jan 20 18:46:43 2003) WWW-POST
do you guys have clues? Thanks in advance |
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v***a
发帖数: 1242 | 11 第一次做这个，还请大家多多指教。
因为目标蛋白大多在inclusion body里，所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过
柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole，洗液2含10 mM imidazole，
洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。
纯化后跑胶，发现elute后的蛋白不干净，跟小试相比有很多杂band，不过目标蛋白的
band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band，赫然在目标蛋白
处。
这是为什么呢？是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗？
谢谢！ |
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o*****r
发帖数: 156 | 12 suggestions:
1. dissolve inclusion body w/ 8M urea plus 10mM imidazole to block non-
specifical binding
2. after loading, wash w/ buffer containing 10mM imidazole
3. use 10-300 mM imidazole gradient to elute
Then you should be able to get the pure protein.
btw, don't overload the column. |
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b******e
发帖数: 88 | 13 你要是有大的prep grade的柱子比如26/60可以试试不浓缩直接过柱子
我觉得很有可能是你的蛋白浓缩以后已经不happy了，甚至开始precipitate然后被FPLC
里面的filter给滤了，你最后那个峰八成是imidazole，这也解释了为什么你的蛋白不
happy，因为concentrator浓缩事实上也会提高imidazole浓度
我的经验是一根affinity后直接用concentrator浓缩的方法很多情况下对蛋白不是太好
，但是可以用别的方法曲线救国，比方说可以过一根IEC，这样会除去imidazole，出来
的峰也会非常高，不需要浓缩就可以直接上SEC，SEC过后出来的蛋白很多就可以正常浓
缩了 |
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e*******e
发帖数: 342 | 14 最近很是郁闷！本来很是简单的His融合蛋白纯化总是做不出来，不知怎么搞的，无论
是从Sf9细胞表达的蛋白还是E. coli表达的蛋白，蛋白总是洗脱不下来。蛋白上柱时是
在Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+50 mM Imidazole (pH 7.0)的体系中，洗
脱时我用的是Sodium Phosphate (pH 8.0)+50 mM NaCl+200 mM Imidazole (pH 7.0)，
结果蛋白还是结合在Beads上。请问有没有遇到类似情况而又解决掉的？ |
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z********i
发帖数: 610 | 15 用多大浓度的imidazole可以最大限度的减少非特异的结合？
我做了一个negative control：beads only+protein（beads没有用BSA处理），50mM
imidazole，发现很强的非特异的结合。
多谢 |
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w******u
发帖数: 17 | 16 蛋白solve在8M urea,
最后试过用1M imidazole, 1M imidazole+50mM EDTA,大部分蛋白还是在beads上。
估计蛋白stick在bead matrix上，
大家有什么好的办法解决这个问题？ 谢谢！ |
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b******n
发帖数: 4225 | 17 蛋白在eluted fraction里面没了就只可能留在柱子里或者flow through了
除非你提纯了高浓度蛋白酶，自我降解了
aggregate之后size发生了变化了
没有imidazole，离子强度发生了很大变化，毕竟imidazole浓度都不低 |
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g****0
发帖数: 1681 | 18 Keywords: substituted imidazole; Silica-Supported Preyssler Nanoparticle;
benzyl; aromatic aldehyde; triaryloxazoles; multicomponent reaction
欧洲小杂志（IF-0.3）,站内联系,谢谢 |
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S******n
发帖数: 5022 | 19 SONY V5
Patent literature, self-interpretation and summary
Patent Publication No. 2011-216701
Published 2011.10.27
Photochromic film
Light transmittance varies depending on the intensity of incident
light
Low and high light transmittance of incident light
The material is used for hexa aryl bis imidazole derivatives
Measure the amount of light absorbed by the photochromic film
Photochromic film is the wavelength (RGB) for each different material,
wh... 阅读全帖 |
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d*****n
发帖数: 599 | 20 专利：
1. “Carbon-based compositions for reversible hydrogen storage,” W.A.
Goddard, W. -Q. Deng and X. Xu, pending patent, 2003.
2. “Fluorinated imidazole as water-free proton exchange membrane” W.A.
Goddard, W.Q. Deng and V. Molinero, pending, 2005.
3. Six filed provisional patents related to hydrogen storage: CIT-4156-P
, solar cell: CIT-4154-P, fuel cell: CIT-4137-P & CIT-4155-P, molecular
electronics: CIT-4123-P, organic electronics: CIT-4136-P. |
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r****o
发帖数: 105 | 21 跑跑western，用anti-His-tag 抗体看看有没有蛋白。另外Ni-NTA与his-tag
的结合非常不特异。你biacore的结果其实不可信。
很难相信300mM的imidazole还洗不下来.我觉得要么是根本没有蛋白表达
，或者没结合上去。如果是后者，你检查一下你的Ni beads是不是好的。 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 22 ☆─────────────────────────────────────☆
Wanshington (Joudon) 于 (Tue Jan 13 11:40:12 2009) 提到:
最近对酵母表达的蛋白进行去糖基化实验，我想知道蛋白溶液中的咪唑对NEB公司的
Endo f 去糖基化酶是否有影响？
谢谢！
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kevinwan (kevin) 于 (Tue Jan 13 11:50:56 2009) 提到:
Endo Hf ba.
Imidazole won't interfere, of course you can always change the buffer before
enzymatic digestion.
☆─────────────────────────────────────☆
Wanshington (Joudon) 于 (Tue Jan 13 12:53:05 2009) 提到:
Thank kevin !
还有一件事情，就是change buff |
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m****m
发帖数: 395 | 23 Ni柱，最近就试着改Imidazole的浓度、筛选detergent,但是我想问问NaCl的浓度有什
么讲究吗？还有Tris溶液要从头到尾都加吗？这些盐对提纯蛋白有何影响？（PS.我
NaCl浓度试过500mM，300mM，100mM） |
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C*********m
发帖数: 213 | 24 银染都染不上？还有个办法，做Zinc-Imidazole negative staining，我记得也是可以
定量的。 |
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c**a
发帖数: 94 | 25 his tagged 的蛋白用nickel resin纯化出来,在elution buffer里, buffer里有
imidazole, sodium
phosphate. 一共1ml. 以后需要做activity asssy, 请问怎么保存才能不失活性?
是不是要加protease inhibitors, glycerol? 加多少glycerol? 冻-20还是-80? |
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l*******k
发帖数: 361 | 26 先透析，去掉imidazole， glycerol 5-10%, protease inhibitor不是必须的，可以加
一点EDTA, 1mM, 绝大部分serine protease没有Mg离子都没有活性了，有的蛋白要加DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
然后分装，用液氮进行迅速冷却，然后保存在-80, 有些比较脆弱的蛋白即使这样保存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
推荐你去读一下一个科大师兄写的从纯化到星辰，里面提到了很多蛋白提纯跟保存的技
术，对于做蛋白的很有帮助 |
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a****k
发帖数: 1130 | 27 偶来补充自己的看法吧：透析不是必须的，只要imidazole不影响activity就好。一般
不用再加protease inhibitor，因为细胞裂解的时候不是已经加过了吗。不建议加EDTA
，不知道lz是要做什么activity assay，很有可能这个蛋白本身自己就是需要镁离子的。
glycerol，对于一般的蛋白我们都是加10%，然后分装后用液氮冻完存在－80度。但是
碰到很不好保存的蛋白，比如冻了一两个月就没有activity的，把glycerol加到20％会
有帮助。
DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白 |
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c**a
发帖数: 94 | 28 谢谢大家, fresh的蛋白还在elution buffer里时 就做过activity assay, imidazole不影响活性. 放4度
一个星期之后蛋白就不行了. 所以想存在低温下.
回头拜读一下从纯化到星辰. |
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r*******i
发帖数: 112 | 29 glycerol 是蛋白稳定剂（因蛋白而异）并能保护蛋白在急冻时候少受破坏 >=5%才有用
imidazole 是弱的denaturant, 很多蛋白不喜欢
EDTA 是金属chelator, 如果你的蛋白里没有金属,应该没有伤害,但也没什么用,因为在
提纯中用EDTA 可以抑制金属蛋白酶
很多时候100mM KCl (or NaCl, (NH4)2SO4)with/without 50 mM Arg 增加可溶性和稳
定性, 原理很有争议, 也有用 Arg + Asp
最后, 浓缩,离心,分装,急冻 (N2 liquid), -80
or 50%glycerol -20 |
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l*****m
发帖数: 98 | 30 1, the sample you get will be those proteins without histine tag. the his-
tagged protein only comes out when you wash them with imidazole
2, i think they will still have the activity if it is folded
3, i donot know. |
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s*******e
发帖数: 1010 | 31 try on-gel cleavage instead of eluting with imidazole |
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I*****y
发帖数: 6402 | 32 increase imidazole concentration, and pH to 8.0 |
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V********n
发帖数: 305 | 33 Imidazole浓度不够。用到1M（或者0.5M？总之200 mM 是不够的），应该能下来。俺之
前遇到过类似情况。 |
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m**z
发帖数: 787 | 35 dialysis不就行了，干吗非要desalting column呢
desalting |
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H*g
发帖数: 2333 | 36 Thanks for all the feedbacks!
Does Dialysis take too much time? I am just too lazy, since desalting column
seems easier. |
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K****a
发帖数: 161 | 37 刚做的，直接透析就行了，4度透析两次，每次1个小时，搞定。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 38 计划做一个protein的tetramer，然后用tetramer做binding.
思路是：
1) express protein from 293T supernatant，purify by HIS column
2）in vitro biotinylation by BirA biotin ligase (site-specific)
3) add streptavidin-PE to make TETRAMER
请问大家觉得我这个思路可以吗？
哪位做过TETRAMER的，还请不吝赐教啊～～～多谢了～～～
另外，能请各位看看下面的内容给提点意见吗？因为克隆测过序没问题，但是现在还没
看到secretion的表达 = =
在protein的N端加上：
kozak-preprotrypsin signal peptide（for secretion，貌似这样产量会高一些，而
且可能提纯好做一些）, AviTag peptide (AviTag 是BirA ligase的识别site，可以用
来做site specific的biotinylation)
preprotrypsin ... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 39 Re this.
应该能够bind到resin上，可能结合力下降一些（Imidazole洗脱的浓度低）。有时候不
一定是坏事，可能会提高分辨率。
much |
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l*******1
发帖数: 128 | 40 I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
Of course, you can chang... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 出现这种情况很正常啊。
因为本来就是一个dynamic competition 的过程，如果你结合在柱上的蛋白
特别多，就是在比较低的浓度的时候就会有蛋白开始被imidazole 置换出来 |
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o*****r
发帖数: 156 | 42 For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein. |
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o*****r
发帖数: 156 | 43 This should not happen.
You know that you should never trust the Abs value when it's more than 2.
1. What is your reference in UV measurement?
2. Do you have anything in the buffer that absorbs at 280nm, for example
imidazole?
3. What't the extension coefficient of your protein?
5 ( |
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s*******e
发帖数: 1010 | 44 what is in ur protein sample is most important. If it is hi-imidazole
elution, there will lots of small molecules have absorbance at 280nm and
they will go through membrane very easy |
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M*******C
发帖数: 183 | 45 我看了一下网站，兼容的试剂名单里没有SDS，你用它来做SDS的样品好用吗？
你说的蛋白沉淀下来再测是什么意思？就是裂解-离心-取上清？
比如我的细胞，我加了含SDS的去裂解，为了核蛋白，这样lysate很粘，我就去超声，
等离心后经常看不见沉淀，直接就拿去用了。
The RC DC protein assay is compatible with the following reagents and
buffers in addition to those compatible with the DC protein assay:
CHAPS 2% ReadyPrep sequential extraction reagents 2 and 3
DTT, 350 mM Sodium hydroxide, 2.5 M
EDTA, 0.1 M TBP, 2 mM
Imidazole, 0.5 M Tris, pH 8.4, 0.5 M
Laemmli buffer with 5% β-mercaptoethanol ... 阅读全帖 |
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o*****r
发帖数: 156 | 46 Qiagen NTA, add 10-25 mM imidazole in the sample and buffer to reduce non-
specific binding |
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j******3
发帖数: 5244 | 47 一个是binding时候里面imidazole的浓度
洗脱的时候从binding浓度洗脱，50往上做梯度，直到500
然后page，看哪些浓度出来条带
收集洗脱液，浓缩 |
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s******9
发帖数: 283 | 50 透析或过desalting column，蛋白提纯的常规操作。 |
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