p******i
发帖数: 1092 | 1 计划做一个protein的tetramer，然后用tetramer做binding.
思路是：
1) express protein from 293T supernatant，purify by HIS column
2）in vitro biotinylation by BirA biotin ligase (site-specific)
3) add streptavidin-PE to make TETRAMER
请问大家觉得我这个思路可以吗？
哪位做过TETRAMER的，还请不吝赐教啊～～～多谢了～～～
另外，能请各位看看下面的内容给提点意见吗？因为克隆测过序没问题，但是现在还没
看到secretion的表达 = =
在protein的N端加上：
kozak-preprotrypsin signal peptide（for secretion，貌似这样产量会高一些，而
且可能提纯好做一些）, AviTag peptide (AviTag 是BirA ligase的识别site，可以用
来做site specific的biotinylation)
preprotrypsin signal peptide序列是我直接copy pCMV-FLAG-1的序列……
C端加上 6XHIS 和c-myc tag
直接跑lysate westernHIS可以看到表达，直接跑supernatant westernHIS看不到
昨天过了个HIS column，用0.5M imidazole去elute,
结果这下子lysate和supernatant 都看不见了……
我用的是Genscript的polyclonal anti-his，价钱很便宜…… |
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