p******i
发帖数: 1092 | 1 计划做一个protein的tetramer，然后用tetramer做binding.
思路是：
1) express protein from 293T supernatant，purify by HIS column
2）in vitro biotinylation by BirA biotin ligase (site-specific)
3) add streptavidin-PE to make TETRAMER
请问大家觉得我这个思路可以吗？
哪位做过TETRAMER的，还请不吝赐教啊～～～多谢了～～～
另外，能请各位看看下面的内容给提点意见吗？因为克隆测过序没问题，但是现在还没
看到secretion的表达 = =
在protein的N端加上：
kozak-preprotrypsin signal peptide（for secretion，貌似这样产量会高一些，而
且可能提纯好做一些）, AviTag peptide (AviTag 是BirA ligase的识别site，可以用
来做site specific的biotinylation)
preprotrypsin ... 阅读全帖 |
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i********e
发帖数: 50 | 2 有个超大蛋白，单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态，是
monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
monomer/tetramer？
native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话，使用的抗体和
monomer或tetramer结合的效果会有差异吗？比如monomer的结合效果好，band清晰。抗
体和tetramer 反应弱，看不大出来band?
比较奇怪的是，6％的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
跑出去了？不应该啊.
求高人指点。 |
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i********e
发帖数: 50 | 3
faction，然后用这些fraction做western blot （注：这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根
本就不重要，你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面）。gel filtration的每
个fraction根据和standard蛋白位置的比较，是可以知道大概的size的，那不就知道你
的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda，到时候不就知道是monomer还是
tetramer了吗
我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的，western 的结果也没问题。
现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话，假如原本是tetramer的蛋白也会变性成
monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是
我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda，一般gel filtration用的
standard 蛋白没有那么大的。最理想的结果是tetrmer在void volume,monomer不是。
用什么柱子能使2者的re |
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d***l
发帖数: 129 | 4 Real-space imaging of interfacial water with submolecular resolution
Abstract
Water/solid interfaces are vital to our daily lives and are also a central
theme across an incredibly wide range of scientific disciplines. Resolving
the internal structure, that is, the O–H directionality, of water molecules
adsorbed on solid surfaces has been one of the key issues of water science
yet it remains challenging. Using a low-temperature scanning tunnelling
microscope, we report submolecular-resolution ima... 阅读全帖 |
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d********r
发帖数: 303 | 5 water channel has the similar configuration as chloride channel. That means,
each subunit is an independant channel. But it forms tetramer. So one tetramer
has four channels.
question about water selectivity. No charge this time.
But the problem remains same. That is we need something to "bind" the water
but not too tightly. the channel is designed in such way that most of it is
hydrophobic but has hydrophilic patches on it, which solved both problems.
Another thing need to be addressed is the s |
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d********r
发帖数: 303 | 6 The structure of aquaporin -1 has been solved. it is a tetramer. But more like
chloride channel, each of its four subunit has an independant pore. So the
tetramer actually is composed by four channels. (see figure below)
The selection problem is solved by arranging three hydrophlic patches along
the
hydrophobic channel wall. This hydrophilic patches contribute four water
binding sites and form the selective filter. Look at the following figure.
Four water molecules (green sphere) are shown here, |
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i********e
发帖数: 50 | 7
有抗体，western 没问题。问题是要鉴别是monomer还是tetramer.SDS-PAGE是变性蛋白
，出来的都是monomer了。实验目的是确定蛋白的状态，目前只想到native page 和gel
filtration.
谢谢你关于柱子的建议，打算试一下。可是出来的fraction还是需要别的方法来确定到
底是monomer或tetramer吧。就算出来2个peak,怎么能说是2种不同状态呢？ |
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m**z
发帖数: 787 | 8 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
益于你对这个蛋白性质的了解得。
或者能不能同时也试试看crystal呢？也许能多一点机会。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 9 DsRed……
如果是做fusion这个蛋白尽量还是不要去沾
因为这个蛋白需要形成tetramer才能正常emit
如果所在的微环境不适合tetramer形成你很难看到一大片荧光
做定位的话也不可靠
另外DsRed-Express的荧光强度只有EGFP的58%左右 |
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d********o
发帖数: 337 | 10 如果你还需要其他证据才相信我说的是事实，请告诉我。
我们都学过Science. 如果想法和事实不符，应该改变的是想法。
我在马里兰大学读有机化学 Ph.D.的时候，发现一种nucleoside形成pentamer,
而不是常见的tetramer such as G-quartet.
http://scholar.google.com/citations?view_op=view_citation&hl=en
其实此前实验室里的印度人已经观测到类似的情况，但是他，出于某种原因，
还是stick to the original model, 没有想到会有五角对称的nucleoside assembly,
结果发表的文章被证伪了。 |
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g*********y
发帖数: 123 | 11 "说一些东西的时候不要想当然" 太对了.
我在搞交叉学科之前和你想得差不多, 但其实劲不起细想. 比如,上面有人已经指出,
只有蛋白或rna的东西往往是寄生，那你哪来的主体？
是，我是不知道原始汤中有什么东西，但我知道形成一般意义上的生命需要什么东西 -
- 核酸，氨基酸，是，浓度我也不知道，可是我知道这些东西都是有离解常数的，如果
浓度很高（比如像楼上那位的汤），这些东西离解会大于合成的（艾滋病毒没有dna，
可在室温下不到24小时就离解了，这就是为什么一般人不会轻易得艾滋病的原因）。而
分子多聚物的浓度是随级数呈指数递减的， 即，如果反应常数相同，假如dimer的浓度
是monomer的一半，那tetramer的浓度就只有monomer的1/4,这样下去，即使形成生命只
需要30mer, 你可以想象一下单体的浓度得多大，可能真得像楼上那位的汤。这样浓度
的原始汤如果不是想当然，应该不存在的。
更何况，生命还需要，30mer RnA(or DNA) + 30mer (protein) + 合适的三级结构，如
果不是想当然，你必须承认 -- 难，这真是很难。
简单一点，细胞里一切都是 |
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e****o
发帖数: 268 | 12 陈慰峰院士研制的肿瘤抗原疫苗批准进入新药临床研究
北京大学医学部免疫学系陈慰峰院士领导的T细胞研究室在肿瘤抗原克隆鉴定及
免疫应答分析、肿瘤疫苗研制等方面取得显著成果。近期，该实验室顺利完成了癌-睾
丸抗原（CT抗原）NY-ESO-1抗原肽（NY-ESO-1b）的临床前研究工作，他们研制的肿瘤
抗原NY-ESO-1b多肽疫苗现已通过中国药品食品监督管理局（CSFDA）药审中心评定，获
得新药临床研究批文。
在国家“863计划”等科学基金支持下，陈慰峰院士实验室建立了肽-MHC分子四
聚体（tetramer）、IFN-γ及GranzymeB/perforin释放的酶联免疫斑点法（ELISPOT）
、胞内细胞因子释放法等国际公认的检测特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的实验体系
。借助这些先进方法，该实验室证明了在肝癌患者中，约有1/3病人对NY-ESO-1b抗原肽
有特异CTL应答；通过ELISA方法检测，约有30.8%的患者体内自发产生了针对NY-ESO-1
抗原的体液免疫应答；同时发现在HLA-A2+ NY-ESO-1 mRNA+ 患者存在功能性 |
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s********l
发帖数: 1195 | 13 我不是做结晶的，最近拿到一个蛋白结构，一个晶格里面有四个monomer，每个monomer
的氨基酸序列是一样的，但是四个chain的conformation不完全一致，其中A和C对称，B
和D对称。
现在想要通过计算每两个chain之间的backbone和sidechain的rmsd来定量地说明A和C
identical，B和D identical
请问该如何计算呢？有什么软件推荐的？
我看到有FATCAT，Mammoth，Dali，还有其他一些，一点概念都没有，不知道用哪个好
，请专家指点下。
另外，看到大部分软件需要upload要比较的两个结构，我只有一个tetramer的pdb file
，怎么把单独的monomer存成一个新的pdb file呢？我知道该怎么用pymol去掉其他的
chain，但是每次都只能存成新的session，而不是新的pdb，这个有什么trick呢？
多谢！ |
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a*m
发帖数: 1217 | 14 On April 2, 2010, Dr. Bing Zhu’s lab published a paper “Partition of
histone H3/H4 tetramers during DNA replication dependent chromatin assembly
” in science. |
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j*****y
发帖数: 94 | 15 我的蛋白是个homodimer，蛋白的结晶已经作出来了。dimer interface is formed by
3 helixes from each
protomer，但是两个protomer 不是像手掌对手掌那样的完全对称interact, 而是两个
protomer之间交叉对称 ，i have
tried a bunch of single-site, double and quadruple mutations to try to
disrupt the dimer but failed. 因为
protomer不是整个helix在interact, 而是有一定角度的，所以不知道为什么两个
protomer之间的作用力会这么强。我们用
的是glycerol gradient sedimentation analysis 来确定 s value， 我试过用没有
salt 的 gradient, 结果蛋白变成了
tetramer; 在高浓度salt gradient 下，仍然是dimer.
我曾经想过能不能在helix 和 helix 之间的loop 那儿插入一小段peptide |
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a****k
发帖数: 1130 | 16 你不是有抗体的吗，gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
方面的实验，是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
position出来的，monomer和tetramer肯定是可以分开的 |
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i********e
发帖数: 50 | 17
of
非常感谢！请问DLS跟CD是一回事吗？我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
，以前跟老板提过用DLS来做，结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
一窍不通。DLS是CD？ |
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m**z
发帖数: 787 | 18 Gel filtration also worth a try. It may be easier if you have the right
column and can separate the monomer/tetramer. |
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a****k
发帖数: 1130 | 19 就是说，你拿自己的sample run一个gel filtration column，collect每一个faction，然后用这些fraction做western blot （注：这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要，你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面）。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较，是可以知道大概的size的，那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda，到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗
gel |
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h******e
发帖数: 44 | 20 呵呵。我觉得这个评论也有点过。别的不说，就麦同学晶体里看到钾通道是个tetramer
，刚好对应HH方程里面钾电流的那个四次项参数，这晶体就值了。当然你可以要求更多
，更多，更多细节，反正晶体学就是拼命拍电影做snapshot，但总有个度评判什么是好
的什么不是 :) |
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z**m
发帖数: 50 | 21 请教版上有没有了解E.coli beta galactosidase结构功能的大牛？目前准备个试验，
需要构建无活性的beta galactosidase突变体做control，因为不是生物背景，查了很
多文献，还是没有头绪，不知道哪些位点的突变或者缺失可以完全abolish beta
galactosidase的活性但是又不影响酶的正常tetramer结构的。有没有哪位大牛可以指
点一下或者提供一两篇类似的文献报道？包子答谢！谢谢！ |
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b******n
发帖数: 4225 | 22 对于荧光蛋白来说，如果要做fusion，最值得考虑的是三点
1）颜色
2）发光形式是多聚还是单体。最好是单体，比如EGFP，AcGFP, mCherry，mStrawberry。
DsRed，ZsGreen等等都是臭名昭著的tetramer，做了fusion之后经常一个皿中没几个发
光的，这种发光的细胞往往对于研究是无效的（这种定位不可靠）
3）relative brightness。如果以EGFP为100，那么GFP(48)，AcGFP(82),mCherry(47)
mStrawberry(78), DsRed(176),DsRed-Express T1(58)，DsRed-Monomer(10),Zsgreen(
117)
相对而言，别的参数大部分都是浮云
如果不做fusion，尽可以选择那些相对发光强度大的比如DsRed,Zsgreen |
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s******y
发帖数: 220 | 23 我的project是杂交了两个line的老鼠，一个是心脏病模型，另一个是特定磷酸化位点
被disable的老鼠（S-A mutation）。因为disease model本来就是个不纯的遗传背景，
然后我又不怎么懂这些老鼠遗传，所以老鼠们一直都有mixed genetic background的问
题。
文献里关于这个磷酸位点的作用本来就很大争议，有人说这个mutation能帮助救助心脏
病，有人说没用。现在我们发现，治病是不太可能了，相反，在这个位点是
heterozygous的时候，这个病更严重了，所谓的heterogeneous disadvantage。因为我
们这个研究的蛋白是个tetramer，所以我们搞出一个hypothesis来解释这个现象，我还
在做一些实验来验证我们的理论。
请问我们观察到的这个现象是由于遗传背景不纯的可能性有多大呢？我的control都是
litter match的啊，所以虽然是个mixed background，但是是可比的。 我觉得现象应
该是真实存在的。
但是现在我在写proposal，虽然我有个hypothesis来解释这个现象，也有一个些... 阅读全帖 |
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b*****g
发帖数: 26 | 24 我最近想build一个structure model. 现在已有receptor cryo-EM tetramer
structure . 有一个小protein 和这个receptor 有interaction,而且比例是1:1.
我们有一些关于protein-protein interaction的数据，也可以docking 到单体上。但
是四聚体就有一些问题。因为如果是1：1，在四聚体上就是4：4，一共8个protein。
所以请大家个我推荐个docking program ，可以解决这个问题。 先谢过了。 |
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t*d
发帖数: 1290 | 25 多谢。
今天看了一片zhang yi 的老综述。这个 histone marker 怎么在细胞分裂是被复制的
机理还不是很清楚。
里面提到 H3/H4 dimer 可能比 H3/H4 tetramer 更稳定。这个倒是个好的蛮好的解释
。可惜被证伪了。 |
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j*b
发帖数: 341 | 26 这个PKM2和肿瘤代谢的关系已经知道很久了，这两篇还不是原创贴。
cantley还可以发nature，能不能解释一下？
Anticancer Res. 2003 Mar-Apr;23(2A):1155-8.
Tumor marker pyruvate kinase type tumor M2 in patients suffering from
diabetic nephropathy.
Oremek GM, Rutner F, Sapoutzis N, Sauer-Eppel H.
Source
Central Laboratory, Hospital of the Johann Wolfgang Goethe-University,
Frankfurt/Main, Germany.
Abstract
INTRODUCTION:
Compared to normal tissues all tumors investigated so far and especially
those with a metastatic potential overexpress an isoenzy... 阅读全帖 |
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j*b
发帖数: 341 | 27 这个PKM2和肿瘤代谢的关系已经知道很久了，这两篇还不是原创贴。
cantley还可以发nature，能不能解释一下？
Anticancer Res. 2003 Mar-Apr;23(2A):1155-8.
Tumor marker pyruvate kinase type tumor M2 in patients suffering from
diabetic nephropathy.
Oremek GM, Rutner F, Sapoutzis N, Sauer-Eppel H.
Source
Central Laboratory, Hospital of the Johann Wolfgang Goethe-University,
Frankfurt/Main, Germany.
Abstract
INTRODUCTION:
Compared to normal tissues all tumors investigated so far and especially
those with a metastatic potential overexpress an isoenzy... 阅读全帖 |
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T****i
发帖数: 15191 | 28 理论上来说，做两个constructs，分别用两个不同的tag，＋／－ DNase，然后IP/
western。这能证明是dimer 或更大。如果需要证明不是trimer, tetramer，。。。就
是dimer，需要分子筛。 |
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H*******i
发帖数: 196 | 29 LacI的monomer dimer tetramer对synthetic biology的一些设计就很重要，会直接影
响能观测到的现象/表型
而且简单的hill function对很多相关动力学现象的解释就不好，需要加入时间参数，
这个和多聚体就很有关系了。 |
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p**t
发帖数: 160 | 30 How to measure antigen-specific T cells？ Tetramer？
T |
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L**S
发帖数: 7833 | 31 要看某种特异antigen的T cell，cytokine明显不行。
要么elispot，要么tetramer staining |
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c**********n
发帖数: 177 | 32 http://tetramer.yerkes.emory.edu/
Check this facility，I think they can make both DR1 and DR4 loaded with
desired peptide.
If you are wondering how good the peptide can be loaded on the MHC, you can
check
whether the peptide contains the docking residues for the MHC. |
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c********n
发帖数: 225 | 33 谈谈和蛋白打交道的日子 （八）
第八篇 轮回
引子
主题构思于美国独立日，一个国家的生日。每一个新事物的产生，往往都伴随着老事物
的离去。日月轮回， 周而复始。这在LIVE乐队一首经典的Lighting Crashes MTV里，
有着令人心动的视觉体现。旋律混合着实验室几个人深夜coffee break的aroma，深深
印在脑海：
oh now feel it comin' back again
like a rollin' thunder chasing the wind
forces pullin' from the center of the earth again
I can feel it.
这次来简单思考一下轮回吧。
最近施一公与Sjors Scheres合作得到了4.5A 分辨率γ secretase的晶体结构， 和
amyloid生成相关， 涉及到了蛋白在体内轮回的重要性，特别是在neurological
diseases的集中体现。
蛋白aggregation是一点一滴积累起来的，一旦形成就很难被细胞正常的protein
degradation机制消化掉。大量垃圾... 阅读全帖 |
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a****u
发帖数: 87 | 34 MHC-tetramer stain for antigen specificity
T-bet staining for anti-tumor Type 1 function; you can also restimulate
these cells and analyze IFNr secretion as a marker for T cell response |
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c**********n
发帖数: 177 | 35 如果非要做流式，换成B的tetramer或者pentamer做也许可以。表面受体和ligand的
affinity一般都不高，很多都是到uM级别。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 36 这个肯定不是经典的酶反应动力学
enzyme是不是有多个subunit？Dimer tetramer？
这种情况可以考虑inhibitor有相互作用 例如有synergy
可以研究下Hill Coefficient |
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i***l
发帖数: 1656 | 37 agree with above,maybe oligomer due to non specific hydrophobic interactions
, which is not uncommon among transmembrane proteins.
4-6M urea, try to completely denature your sample,
however, if oligomer forms, sample usually runs in a ladder pattern, say,
dimer, tetramer, etc. if you only see two major bands, one monomer, the
other ~4x or 6x apparent molecular weight, it's still a little weird to me. |
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d***g
发帖数: 9 | 38 很多年轻人到美国都想要申请大学的护士专业，也就是英文所说的Nursing，因为几乎
每个人都说护士可以在美国申请到绿卡，可以赚年薪起薪6万，那为什么有人说简单，
有人说复杂，这其中究竟有什么诀窍呢？
那么下面整个介绍一下在美国做护士的步骤，以及申请绿卡的条件。
这篇文章会介绍几个部分的内容，
包括：
1 申请护士职业移民最基本的条件和优点。
2国内护士专业毕业，人在美国，或人不在美国，如何申请美国大学的护士专业或申请
护士执照考试和如何进行职业规划。
3国内高中毕业，有高中毕业文凭，人在美国，如何申请美国大学的护士专业。
4国内大专或本科毕业（非护士专业），有高中和大学文凭，如何申请美国大学的护士
专业。
5 已经有身份（有绿卡或是美国公民），但是想申请护士专业，如何申请美国大学的护
士专业。
6 通过考试后，取得美国护士执照，通过托福考试后，如何找医院面试谈判，如何找律
师递交移民申请，如何关注职业移民配额，最终申请绿卡。
7 注册护士考试的英文名称和考试内容，那里可以买参考书，网上有哪些资源。
8 申请过程中常见的困难和困扰有那些
9 托福考试的复习与报考准备
10 附录 护士注册... 阅读全帖 |
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