t**l
发帖数: 109 | 1 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer |
C*******e
发帖数: 4348 | |
f*****f
发帖数: 195 | 3 方法很多：
一种是稳定的dimer，比如二硫键形成的dimer，SDS lysis buffer 也不能破坏，
Western blot会有两条带，刚好两倍差别。一定要确定的话可以IP后可以mass-spec
二假如SDS lysis buffer 会破坏，可以先IP后，sucrose gradient或是分子量层析，
至少有2个component
三，假如蛋白能纯化出来的，就更容易了。直接GST-protein过分子筛。
四，IP或pull down用外源蛋白可以沉淀下endogenous protein，说明可以形成dimer或
polymer
五，X-ray and structural determination确定dimer结构
【在 t**l 的大作中提到】
: 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer
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C*******e
发帖数: 4348 | 4 为什么一定是“GST-protein过分子筛”？ |
T****i
发帖数: 15191 | 5 理论上来说，做两个constructs，分别用两个不同的tag，＋／－ DNase，然后IP/
western。这能证明是dimer 或更大。如果需要证明不是trimer, tetramer，。。。就
是dimer，需要分子筛。
【在 t**l 的大作中提到】
: 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer
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f*****f
发帖数: 195 | 6 不用，只是gst为例，只要能纯化出来就行。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 为什么一定是“GST-protein过分子筛”？
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K****a
发帖数: 161 | 7 GST自己不是会形成dimer吗？
【在 f*****f 的大作中提到】
: 不用，只是gst为例，只要能纯化出来就行。
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a*******e
发帖数: 245 | 8 你说得对
gst 可以induce target protein to form dimer
所以gst tag 不是一个非常好的手段
【在 K****a 的大作中提到】
: GST自己不是会形成dimer吗？
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t**l
发帖数: 109 | 9 请问一下gel filtration 能给出什么定量的结果吗？ 能具体的说明哪块elute是多少
kd. |
s*********y
发帖数: 292 | 10 有gel filtration的marker卖的
【在 t**l 的大作中提到】
: 请问一下gel filtration 能给出什么定量的结果吗？ 能具体的说明哪块elute是多少
: kd.
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p*****e
发帖数: 93 | 11 after purification, you cleave the GST off.
【在 t**l 的大作中提到】
: 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer
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y******n
发帖数: 8667 | 12
GST tag本身就会形成 dimer.
【在 f*****f 的大作中提到】
: 不用，只是gst为例，只要能纯化出来就行。
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y******n
发帖数: 8667 | 13
找篇文章看看吧，看怎么确定分子量。一般加对照。
【在 t**l 的大作中提到】
: 请问一下gel filtration 能给出什么定量的结果吗？ 能具体的说明哪块elute是多少
: kd.
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g*****p
发帖数: 451 | 14 这么多tag的例子你不举，偏偏举这个
gst is naturally a dimer
【在 f*****f 的大作中提到】
: 不用，只是gst为例，只要能纯化出来就行。
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t*****2
发帖数: 213 | 15 最直接有力的证据，也是最常用的方法就是跑变性和非变性胶。 |
g*****p
发帖数: 451 | 16 你可以用接近10种方法来证明
但是无偏的方法学还是纯化蛋白后用静态光散射和超速离心来鉴定
【在 t**l 的大作中提到】
: 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer
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g*****p
发帖数: 451 | 17 X光测定可不能证明二体结构
最多可以说明其相关性
【在 f*****f 的大作中提到】
: 方法很多：
: 一种是稳定的dimer，比如二硫键形成的dimer，SDS lysis buffer 也不能破坏，
: Western blot会有两条带，刚好两倍差别。一定要确定的话可以IP后可以mass-spec
: 二假如SDS lysis buffer 会破坏，可以先IP后，sucrose gradient或是分子量层析，
: 至少有2个component
: 三，假如蛋白能纯化出来的，就更容易了。直接GST-protein过分子筛。
: 四，IP或pull down用外源蛋白可以沉淀下endogenous protein，说明可以形成dimer或
: polymer
: 五，X-ray and structural determination确定dimer结构
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b******s
发帖数: 1089 | 18 跟帖问一句。证明一个TF是dimer还是monomer有什么大的生物学意义吗？当然可能对TF
的function, mobility等有潜在的调控作用。但在我做的传统发育里，看到的大部分都
还是集中在TF的调控基因上。
【在 t**l 的大作中提到】
: 做genetic screen找到一个transcription factor. 怎么证明这个TF是dimer
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H*******i
发帖数: 196 | 19 LacI的monomer dimer tetramer对synthetic biology的一些设计就很重要，会直接影
响能观测到的现象/表型
而且简单的hill function对很多相关动力学现象的解释就不好，需要加入时间参数，
这个和多聚体就很有关系了。 |
g*********5
发帖数: 2533 | |
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d*****s
发帖数: 647 | 21 我们以前做过eNOS的dimer和monomer，程序如下：
正常提取蛋白，按照常规Western Blot准备标本
将标本分为2份：一份boiled，一份unboiled
在4度下跑SDS-PAGE胶
然后Western blot程序
最好在胶片上判断：Boiled的标本只有1条monomer带，unboiled的标本在2倍monomer分
子量位
置有条带表示是dimer |
C********4
发帖数: 308 | 22 不boil的是不是还不能加DTT啊
是否还需要一块非变性胶
【在 d*****s 的大作中提到】
: 我们以前做过eNOS的dimer和monomer，程序如下：
: 正常提取蛋白，按照常规Western Blot准备标本
: 将标本分为2份：一份boiled，一份unboiled
: 在4度下跑SDS-PAGE胶
: 然后Western blot程序
: 最好在胶片上判断：Boiled的标本只有1条monomer带，unboiled的标本在2倍monomer分
: 子量位
: 置有条带表示是dimer
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o****e
发帖数: 1011 | 23 嗯。得到pure的样品后，看方便用到什么设备了。
以前所在的化学实验室是利用Size Exclusion Chromatography(Gel Permeation
Chromatography) with online Multi-angle light scattering detection.
做Analytical Ultracentrifugation的话就得送外面专门的实验室了。不过这个
实验时间很长，样品的稳定性是一个需要考虑的问题。
【在 g*****p 的大作中提到】
: 你可以用接近10种方法来证明
: 但是无偏的方法学还是纯化蛋白后用静态光散射和超速离心来鉴定
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t*****2
发帖数: 213 | 24 这就是个jbc的文章。。。。
TF
【在 b******s 的大作中提到】
: 跟帖问一句。证明一个TF是dimer还是monomer有什么大的生物学意义吗？当然可能对TF
: 的function, mobility等有潜在的调控作用。但在我做的传统发育里，看到的大部分都
: 还是集中在TF的调控基因上。
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t****t
发帖数: 86 | |
H*g
发帖数: 2333 | 26 Sorry couldn't type in Chinese here.
Was the result from this analytic method published?
Did the reviewers buy it?
【在 d*****s 的大作中提到】
: 我们以前做过eNOS的dimer和monomer，程序如下：
: 正常提取蛋白，按照常规Western Blot准备标本
: 将标本分为2份：一份boiled，一份unboiled
: 在4度下跑SDS-PAGE胶
: 然后Western blot程序
: 最好在胶片上判断：Boiled的标本只有1条monomer带，unboiled的标本在2倍monomer分
: 子量位
: 置有条带表示是dimer
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