K*C
发帖数: 2825 | 1 pET上只有一个rbs，insert一段序列上有两个蛋白gene，两个gene间有一段non-coding
序列，那么这段序列是不是也要加上rbs？ |
x*****g
发帖数: 42 | 2 当然。最好promoter也有。参见 Duet vector系列
coding
【在 K*C 的大作中提到】
: pET上只有一个rbs，insert一段序列上有两个蛋白gene，两个gene间有一段non-coding
: 序列，那么这段序列是不是也要加上rbs？
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K*C
发帖数: 2825 | 3 多谢。我们组以前从一细菌clone的一个heterodimer protein,然后俩protein gene之
间那段序列是TTAATATTTTCTAAAAGGAAAGAGAC，其中AAGGAA是rbs，但是不是E.coli里面
最常见的，前面那段序列我觉得是有TAXXAT，应当是个promoter。你觉得呢？
然后这clone到pET里面也能很好表达。就是不知道前面一个protein是否比后面一个多
，因为两个一表达出来就bind到一起了。
【在 x*****g 的大作中提到】
: 当然。最好promoter也有。参见 Duet vector系列
:
: coding
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h**********r
发帖数: 671 | 4 第二个加上RBS，但non-coding region有影响。不加promoter就是个多顺反子，常见的
基因组织方式。
参见：
Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression
of multiple genes
Nature Biotechnology 24, 1027 - 1032 (2006)
Published online: 16 July 2006 | doi:10.1038/nbt1226
http://www.nature.com/nbt/journal/v24/n8/abs/nbt1226.html
一般情况下，不用太过分苛求。
谢谢！ |
s******y
发帖数: 28562 | 5 如果你这些non-coding sequence 是从你们原先的细菌genome里面来的话，
里面应该就有天然的promoter and RBS,在这种情况下不要乱加东西，
否则反而容易弄巧成拙
coding
【在 K*C 的大作中提到】
: pET上只有一个rbs，insert一段序列上有两个蛋白gene，两个gene间有一段non-coding
: 序列，那么这段序列是不是也要加上rbs？
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h**********r
发帖数: 671 | 6 以前有些paper做这个的，多个基因的表达，现在我也懒得找了。
另外比较简单的方法，分别把a,b基因克隆在pET21b上，再做一次PCR得到连同启动子，
a基因和terminator，再酶切连接到b基因的表达质粒上。最终a,b都有自己的T7
promoter,都受IPTG诱导。当然诱导程度不一定相同。
这样你就不纠结了。 |
K*C
发帖数: 2825 | 7 多谢诸位帮忙。我还有两个问题想问.
1. 关于Duet vector.就是那种每个gene前加一个T7 promoter和rbs的.何必多加一个T7
promoter呢,直接出一个RNA然后两个ribosome上去translate就是了?
2.在E.coli里面rbs是有几种的,不同的rbs对表达影响大么?有谁试过?
coding
【在 K*C 的大作中提到】
: pET上只有一个rbs，insert一段序列上有两个蛋白gene，两个gene间有一段non-coding
: 序列，那么这段序列是不是也要加上rbs？
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s******e
发帖数: 1073 | 8 pETduet vector 有两个阅读框，可以分别把两个蛋白插入阅读框就可以了。 |
K*C
发帖数: 2825 | 9 我意思是何必多余放两个T7 promoter sequence。放两个rbs，一个T7 promoter
sequence就是了。
【在 s******e 的大作中提到】
: pETduet vector 有两个阅读框，可以分别把两个蛋白插入阅读框就可以了。
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p****c
发帖数: 233 | |
