T**********t
发帖数: 1604 | 1 我一直是用nanodrop测样品浓度，没发现太大问题。但是最近做的实验因为对于浓度测
量要求十分精准，否则实验结果重复性就不好，我用nanodrop对同一管样品反复测量发
现前后误差可以高达15%-20%，让人很抓狂。。。我试过增加点样体积直到5微升，好像
也没什么帮助。我的样品量又不多，实在想不出什么别的好方法给浓度精确定量。 |
m**z
发帖数: 787 | 2 use a UV-vis spec
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我一直是用nanodrop测样品浓度，没发现太大问题。但是最近做的实验因为对于浓度测
: 量要求十分精准，否则实验结果重复性就不好，我用nanodrop对同一管样品反复测量发
: 现前后误差可以高达15%-20%，让人很抓狂。。。我试过增加点样体积直到5微升，好像
: 也没什么帮助。我的样品量又不多，实在想不出什么别的好方法给浓度精确定量。
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m**z
发帖数: 787 | 3 For protein,quantative amino acid analysis will give very accurate
concentration
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我一直是用nanodrop测样品浓度，没发现太大问题。但是最近做的实验因为对于浓度测
: 量要求十分精准，否则实验结果重复性就不好，我用nanodrop对同一管样品反复测量发
: 现前后误差可以高达15%-20%，让人很抓狂。。。我试过增加点样体积直到5微升，好像
: 也没什么帮助。我的样品量又不多，实在想不出什么别的好方法给浓度精确定量。
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w******e
发帖数: 1187 | 4 蛋白的话，我用过lavapep和nanoorange，前者的reproducibility还不错，
sensitivity
在100ng/ml左右吧
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我一直是用nanodrop测样品浓度，没发现太大问题。但是最近做的实验因为对于浓度测
: 量要求十分精准，否则实验结果重复性就不好，我用nanodrop对同一管样品反复测量发
: 现前后误差可以高达15%-20%，让人很抓狂。。。我试过增加点样体积直到5微升，好像
: 也没什么帮助。我的样品量又不多，实在想不出什么别的好方法给浓度精确定量。
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 我倒是想过，不过我们实验室自从买了nanodrop之后，旧的UV-Vis spec都不知道扔哪
儿去了。而且我用来测的样品体积不够大，可能要特殊的cuvette才行。要是稀释的话
，又引入更多误差了。
【在 m**z 的大作中提到】
: use a UV-vis spec
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w******e
发帖数: 1187 | 6 that's hard to do right?
【在 m**z 的大作中提到】
: For protein,quantative amino acid analysis will give very accurate
: concentration
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 谢谢，我去查一下这个看。
【在 w******e 的大作中提到】
: 蛋白的话，我用过lavapep和nanoorange，前者的reproducibility还不错，
: sensitivity
: 在100ng/ml左右吧
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m**z
发帖数: 787 | 8 right... usually need to send the sample to some other place who can run
such assay. But it is probably the best way to accurately determine the
concentration.
【在 w******e 的大作中提到】
: that's hard to do right?
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m**z
发帖数: 787 | 9 I don't agree that dilution will cause error. In fact, I believe measuring
multiple diluted samples will help with the accuracy. You can simply make
several dilutions, measure them using nanodrop and get the average. I think
that is better than measuring the same sample.
Also, better use the UV spec mode and use your own calculated extinction
coeffient to calulate the concentration. don't use the default setting from
nanodrop
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我倒是想过，不过我们实验室自从买了nanodrop之后，旧的UV-Vis spec都不知道扔哪
: 儿去了。而且我用来测的样品体积不够大，可能要特殊的cuvette才行。要是稀释的话
: ，又引入更多误差了。
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 我需要的是测量实验条件下的蛋白浓度，所以我一般是上样之后，用剩下的样品测浓度
，所以样品体积很小。另外我也担心如果把sample送出去，在运输或者对方的实验室保
存的时候样品浓度发生变化或者样品沉淀了降解了什么的。
我也同意做梯度稀释测浓度曲线应该更准，可是我担心样品不够，起始浓度就不高了，
体积还小，估计上样之后的leftover也就几十微升吧，OD280在0.3-0.4左右。
【在 m**z 的大作中提到】
: right... usually need to send the sample to some other place who can run
: such assay. But it is probably the best way to accurately determine the
: concentration.
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m**z
发帖数: 787 | 11 well, that's really very little sample... make several dilutions and measure
by nanodrop is probably the best you can do...
maybe other people will have better idea...
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我需要的是测量实验条件下的蛋白浓度，所以我一般是上样之后，用剩下的样品测浓度
: ，所以样品体积很小。另外我也担心如果把sample送出去，在运输或者对方的实验室保
: 存的时候样品浓度发生变化或者样品沉淀了降解了什么的。
: 我也同意做梯度稀释测浓度曲线应该更准，可是我担心样品不够，起始浓度就不高了，
: 体积还小，估计上样之后的leftover也就几十微升吧，OD280在0.3-0.4左右。
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w******e
发帖数: 1187 | 12 OD280 0.3 means ～0.3 ug/ul right? I think it's enough for lavapep/
nanoorange
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我需要的是测量实验条件下的蛋白浓度，所以我一般是上样之后，用剩下的样品测浓度
: ，所以样品体积很小。另外我也担心如果把sample送出去，在运输或者对方的实验室保
: 存的时候样品浓度发生变化或者样品沉淀了降解了什么的。
: 我也同意做梯度稀释测浓度曲线应该更准，可是我担心样品不够，起始浓度就不高了，
: 体积还小，估计上样之后的leftover也就几十微升吧，OD280在0.3-0.4左右。
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T**********t
发帖数: 1604 | 13 我看了一下lavapep，样品体积最少要100ul，而且我估计那样的话还需要特殊的
cuvette吧。我倒是可以多配一点样品，就是不知道仪器和cuvette上哪弄去。要是还用
Nanodrop的话，岂不是绕了一圈又回来了。。。
还有就是它的定量怎么个定法，是像bradford一样做标准曲线么？
【在 w******e 的大作中提到】
: OD280 0.3 means ～0.3 ug/ul right? I think it's enough for lavapep/
: nanoorange
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w******e
发帖数: 1187 | 14 do you have plate reader? I use fluorescent plate. you can make do with 50ul
yes you need a standard curve
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我看了一下lavapep，样品体积最少要100ul，而且我估计那样的话还需要特殊的
: cuvette吧。我倒是可以多配一点样品，就是不知道仪器和cuvette上哪弄去。要是还用
: Nanodrop的话，岂不是绕了一圈又回来了。。。
: 还有就是它的定量怎么个定法，是像bradford一样做标准曲线么？
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 plate reader好像有一台扔那儿好久没人用了，等我去拾掇拾掇出来看看。我们实验室
杂七杂八的东西还真不少。。。还要买板子，买试剂，真是时间紧任务重啊。 |
m**z
发帖数: 787 | 16 个人认为，bradford类似的方法，都用BSA做standard,这样必须assume BSA behaves
the same as your protein.所以难以用来测蛋白的绝对浓度。我见过Bradford结果和
蛋白实际浓度相差2、3倍的。
感觉楼住的问题是要reproducible results.nanodrop在这点上有时候是不怎么的。。
其实bradford 或者其他方法要reproducible results的话，都是可以做到的，当然要
正确操作以及稳定的仪器。但如果要精确定量蛋白的绝对浓度的话，我觉得这些方法都
不是很好。UV-vis是相对好些的方法，它的assumption是，你的extinction
coeffecient计算正确（通常网上一些工具的结果还是可以的）。还有就是蛋白纯度要
好。这样虽然也有误差，会比bradford好很多。
当然，前面提到的amino acid analysis最好了，不过要特殊的地方才能做。
所以，UV-vis (A280) with calculated coeffecient可能是比较方便的，比较折中的
可以给你相对可靠结果的一种方法。或者说性价比比较高。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我看了一下lavapep，样品体积最少要100ul，而且我估计那样的话还需要特殊的
: cuvette吧。我倒是可以多配一点样品，就是不知道仪器和cuvette上哪弄去。要是还用
: Nanodrop的话，岂不是绕了一圈又回来了。。。
: 还有就是它的定量怎么个定法，是像bradford一样做标准曲线么？
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s********n
发帖数: 2939 | 17 我推荐用BCA的方法，比Bradford准很多。可以测微量和低浓度样品。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 18 顶
UV测怎么都不会准的
而且和蛋白组分有关
我还做过完全没有UV光吸收的蛋白呢
BCA测得比较准
【在 s********n 的大作中提到】
: 我推荐用BCA的方法，比Bradford准很多。可以测微量和低浓度样品。
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l********y
发帖数: 53 | 19 如果你的浓度本身就很低，uv-vis倒是你同一样品平行测几次数字都差不多，但是数字
会无比的低啊。
你这样换算出来的浓度还不如nanodrop靠谱啊。
对比荧光，uv-vis的检测限还是蛮高的，ng/mL这种肯定是不行的，我印象中至少要mg/
mL才能看到比较明显的abs变化，当然也要看你那是什么蛋白，纯度多少也是个问题。 |
m**z
发帖数: 787 | 20 detection limit for uv-vis depends on the Trp and Tyr content.楼主说他sample
OD0.3-0.4,其实是足够了(OD280 between 0.1 and 1 is good)，只不过体积小，所以
用nanodrop.不过nanodrop通常又不reproducible...
mg/
【在 l********y 的大作中提到】
: 如果你的浓度本身就很低，uv-vis倒是你同一样品平行测几次数字都差不多，但是数字
: 会无比的低啊。
: 你这样换算出来的浓度还不如nanodrop靠谱啊。
: 对比荧光，uv-vis的检测限还是蛮高的，ng/mL这种肯定是不行的，我印象中至少要mg/
: mL才能看到比较明显的abs变化，当然也要看你那是什么蛋白，纯度多少也是个问题。
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m**z
发帖数: 787 | 21 UV只和trp,tyr数量有关，可以计算理论吸收值，通常误差大概会在10%左右
你说UV取决于蛋白组分，难道BCA，bradford等就不是了吗？不都取决于蛋白和用来做
standard的BSA的类似度吗？而且这种类似度还是没法量化计算的。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 顶
: UV测怎么都不会准的
: 而且和蛋白组分有关
: 我还做过完全没有UV光吸收的蛋白呢
: BCA测得比较准
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n****n
发帖数: 434 | 22 Nanodrop is a UV-Vis spectrophotometer! It is just in micro-volume.
LZ's nanodrop needs service.
【在 m**z 的大作中提到】
: use a UV-vis spec
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T**********t
发帖数: 1604 | 23 谢谢楼上各位，尤其是mmzz同学。
我想了想，这个reproducibility的问题还是nanodrop的工作原理决定的，nanodrop工
作时的光径只有1mm或者0.2mm。然后把测到的absorbance再转换成10mm光径下的
absorbance。所以OD 0.3的样品，实际上nanodrop测到的absorbance只有0.03甚至更低
，这么低的reading，就很容易受到干扰，所以不太能够精准的测量低浓度的样品。如
果要提高精确度，就必须增强被测量的信号强度，拉大signal/noise ratio，所以用
BCA或者荧光试剂还是有用的。或者用特殊的cuvette和UV-spec，既增加光径，但是又
不需要过大的样品体积，就是不知道有没有这种设备。
不知道我想得有没有道理。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 24 我试过别人实验室的nanodrop，不比我实验室的表现更好。但是除了我，大家都很
happy的在用。。。
从nanodrop自家提供的数据来看，它确实在测低浓度样品的时候表现不如高浓度的样品
，它自己给的数据里最大测量误差也能到13%了。
http://www.nanodrop.com/Library/NanoDrop%201000%20microcell-cuvette-Application-Note.pdf
【在 n****n 的大作中提到】
: Nanodrop is a UV-Vis spectrophotometer! It is just in micro-volume.
: LZ's nanodrop needs service.
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a*****y
发帖数: 277 | 25 Nanodrop is not bad at all in my hand...
You can do a standard curve using BSA solution to check if the instrument is
working fine. If not working properly just pay a PM to fix it... |
m**z
发帖数: 787 | 26 Glad to help!:)
the smallest cuvette on a UV-spec I have used needs 100 ul sample, with a
pathlength of 1cm.
我觉得你对nanodrop的理解是蛮正确的，它节省了样品，但是pay off是稳定性和精确
性。我一般的molecular biology的东西，nanodrop还是很方便的，但是蛋白我总是用
大的UV-spec，尤其是新purify的protein stock,需要精确定量的时候
【在 T**********t 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位，尤其是mmzz同学。
: 我想了想，这个reproducibility的问题还是nanodrop的工作原理决定的，nanodrop工
: 作时的光径只有1mm或者0.2mm。然后把测到的absorbance再转换成10mm光径下的
: absorbance。所以OD 0.3的样品，实际上nanodrop测到的absorbance只有0.03甚至更低
: ，这么低的reading，就很容易受到干扰，所以不太能够精准的测量低浓度的样品。如
: 果要提高精确度，就必须增强被测量的信号强度，拉大signal/noise ratio，所以用
: BCA或者荧光试剂还是有用的。或者用特殊的cuvette和UV-spec，既增加光径，但是又
: 不需要过大的样品体积，就是不知道有没有这种设备。
: 不知道我想得有没有道理。
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s********n
发帖数: 2939 | 27 QuantiPro BCA Assay Kit (Sigma) 的线性范围是0.5-30 ug/ml，样品体积是50 ul，
用96-well plate做，效果很好。
如果你还是倾向于UV，你可以试试岛津的微量cuvette - 5 ul体积，1 cm的光径。 |
m*****u
发帖数: 15526 | 28 我提核蛋白。lysis buffer里有0.4M NaCl, 10%glycerol。感觉对BCA法测量干扰很大。空白的
lysis buffer测出的值就很高。有什么别的办法可以解决么？ |
s********n
发帖数: 2939 | 29 主要是glycerol的干扰，需要buffer exchange.
大。空白的
【在 m*****u 的大作中提到】
: 我提核蛋白。lysis buffer里有0.4M NaCl, 10%glycerol。感觉对BCA法测量干扰很大。空白的
: lysis buffer测出的值就很高。有什么别的办法可以解决么？
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e*******e
发帖数: 1837 | 30 For low-concentration nucleic acid samples, try pico-green based analysis.
Such as the Invitrogen's Qubit system:
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Product-Brand/Qubit.html
It use 1 ul sample and can measure concentration < 1 ng/ul.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我一直是用nanodrop测样品浓度，没发现太大问题。但是最近做的实验因为对于浓度测
: 量要求十分精准，否则实验结果重复性就不好，我用nanodrop对同一管样品反复测量发
: 现前后误差可以高达15%-20%，让人很抓狂。。。我试过增加点样体积直到5微升，好像
: 也没什么帮助。我的样品量又不多，实在想不出什么别的好方法给浓度精确定量。
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a*****y
发帖数: 277 | 31 Many people blame nanodrop for reproducibility. Not sure if that is a rumor
or the truth. I have done several times of standard curve. It behaves very
nice in my case... |
T**********t
发帖数: 1604 | 32 我刚又测过一次，算了%cv，表现比较好的，是OD 0.8左右的核酸样品，%cv在1%左右，
表现差点的，是OD 0.3左右的蛋白样品，%cv大部分在5%左右，但是有一个样品的%cv超
过了10%。10%的误差对我的实验来说影响太大了。
所有的样品都是用的相同的buffer，测之前也vortex过。用的样品体积都是4uL。
相同的样品我在一台Varian Cary 100 UV-Vis spec上测过，样品体积300uL，光径1cm
，测量结果相当稳定，每个样品的%cv都低于0.5%甚至为零。
更郁闷的是，同一个样品在Varian和Nanodrop上测得的OD不一样，Nanodrop的读数比
Varian的普遍高25%以上。
我的Nanodrop肯定是需要calibration了，刚订了那个CF-1，先校准一下再看。。。不
知道calibration对reproducibility有没有帮助。
rumor
【在 a*****y 的大作中提到】
: Many people blame nanodrop for reproducibility. Not sure if that is a rumor
: or the truth. I have done several times of standard curve. It behaves very
: nice in my case...
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B*******d
发帖数: 34 | 33 Please try real time PCR and bioanalyzer,
No single method is perfect. all have different degrees of CV.
Nanodrop is not accurate when the conc. is lower than 5ng/ul.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我一直是用nanodrop测样品浓度，没发现太大问题。但是最近做的实验因为对于浓度测
: 量要求十分精准，否则实验结果重复性就不好，我用nanodrop对同一管样品反复测量发
: 现前后误差可以高达15%-20%，让人很抓狂。。。我试过增加点样体积直到5微升，好像
: 也没什么帮助。我的样品量又不多，实在想不出什么别的好方法给浓度精确定量。
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C*******e
发帖数: 4348 | 34 你非要这么挑刺那样没办法
就像你说的UV只和Trp, Tyr有关；
bradford是基于考马斯亮蓝的dye-binding assay，和组分相关；
BCA虽然受Cys，Cystine,Trp, Tyr影响，但是不要忘了peptide backbone也是有贡献的
，所以和
bradford比variation要小很多。
如果非要把uv，bradford，BCA，甚至lowry assay几者等同那我也不知道该说什么好了
反正每个人知道自己的蛋白（样品）特性，知道每个assay的好处坏处，选最合适的，
也就罢了
【在 m**z 的大作中提到】
: UV只和trp,tyr数量有关，可以计算理论吸收值，通常误差大概会在10%左右
: 你说UV取决于蛋白组分，难道BCA，bradford等就不是了吗？不都取决于蛋白和用来做
: standard的BSA的类似度吗？而且这种类似度还是没法量化计算的。。。
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m**z
发帖数: 787 | 35 没有要把这几种方法等同的意思。完全同意不同要求应该选择不同的方法。我的观点是
，对于一个已知序列的纯化了的蛋白，UV比较好精确定量；当你的样品是两种以上蛋白
混合，比如cell extract,那么bradford,BCA都挺好，用来定量总蛋白浓度。我猜测楼
主的样品应该是纯蛋白，所以建议UV比较好
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你非要这么挑刺那样没办法
: 就像你说的UV只和Trp, Tyr有关；
: bradford是基于考马斯亮蓝的dye-binding assay，和组分相关；
: BCA虽然受Cys，Cystine,Trp, Tyr影响，但是不要忘了peptide backbone也是有贡献的
: ，所以和
: bradford比variation要小很多。
: 如果非要把uv，bradford，BCA，甚至lowry assay几者等同那我也不知道该说什么好了
: 反正每个人知道自己的蛋白（样品）特性，知道每个assay的好处坏处，选最合适的，
: 也就罢了
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p*****n
发帖数: 981 | 36 最精确的方法是用已知的强binding的化合物titrate.
不过比较费事儿
我老板一度认为应该把蛋白热干称重。。。
这个毫无疑问很准。
【在 m**z 的大作中提到】
: 没有要把这几种方法等同的意思。完全同意不同要求应该选择不同的方法。我的观点是
: ，对于一个已知序列的纯化了的蛋白，UV比较好精确定量；当你的样品是两种以上蛋白
: 混合，比如cell extract,那么bradford,BCA都挺好，用来定量总蛋白浓度。我猜测楼
: 主的样品应该是纯蛋白，所以建议UV比较好
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d********e
发帖数: 321 | 37 ELISA也能测蛋白浓度
【在 p*****n 的大作中提到】
: 最精确的方法是用已知的强binding的化合物titrate.
: 不过比较费事儿
: 我老板一度认为应该把蛋白热干称重。。。
: 这个毫无疑问很准。
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C*******e
发帖数: 4348 | 38 hehe，那我误会了
不好意思
另外提一下如果是crude cell extract，最好用lowry assay
【在 m**z 的大作中提到】
: 没有要把这几种方法等同的意思。完全同意不同要求应该选择不同的方法。我的观点是
: ，对于一个已知序列的纯化了的蛋白，UV比较好精确定量；当你的样品是两种以上蛋白
: 混合，比如cell extract,那么bradford,BCA都挺好，用来定量总蛋白浓度。我猜测楼
: 主的样品应该是纯蛋白，所以建议UV比较好
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m**z
发帖数: 787 | 39 haha, 称干重这个强的。。。热干称重更强。。。只听过冻干的。。。
First one is good. I have use that a lot. It usually agrees with my
concentration from UV. That's why I like the UV method.
【在 p*****n 的大作中提到】
: 最精确的方法是用已知的强binding的化合物titrate.
: 不过比较费事儿
: 我老板一度认为应该把蛋白热干称重。。。
: 这个毫无疑问很准。
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T**********t
发帖数: 1604 | 40 昨天我又试了一台岛津的UV spec，它的reproducibility也很好。但是它的读数比
Nanodrop的高7%左右，对比前两天我在Varian上得到的读数比Nanodrop的低25%，我都
不知道信谁好了。我觉得这三台仪器至少有两台都需要calibration了。。。 |
