b**********8
发帖数: 349 | 1 我想了解一段启动子序列甲基化和非甲基化对基因转录的影响（已经证实经某处理
因素处理后该段DNA序列甲基化频率显著降低），已经成功构建了包含该段序列的荧光
素酶报告基因(PGL3 basic vector)，该如何继续下游实验？看到相关的paper，有的是
直接把质粒用 MSss I在体外甲基化修饰后纯化回收后进行转染，比如这两篇文章http://cancerres.aacrjournals.org/content/66/9/4566.full.pdf
http://cancerres.aacrjournals.org/content/61/11/4628.full.pdf
有的则是把特定的启动子序列切下来进行体外的MSss I甲基化修饰，然后重新连接
回原来的vector，把连接液纯化后直接转染，比如这篇paper，http://mcb.asm.org/cgi/reprint/26/22/8572.pdf。
个人觉得第二种方法更严谨。第一种方法虽然简单，但是整个质粒上负责luciferase最
终表达的元件很多，他们的甲基化可能会对实验结果形成干扰。第二种方法似乎更为合
理，但是我觉得有几个问题，首先。质粒连接产物纯化回收过程中是不是特别容易断裂
啊？第二，连接产物中应该还有不少自连克隆吧，这也会对实验有影响的吧？第三，连
接产物转染的时候如何定量？直接把纯化后的产物测OD260和 OD280？
请大家对以上两种方法进行评价，另外，请问还有没有其他思路和方法完成我这个实验
？ |
b**********8
发帖数: 349 | |
s******s
发帖数: 13035 | 3 第一种太糙了，估计其他抗性啥的都不表达了。
你为什么不去问paper的author
【在 b**********8 的大作中提到】
: up
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d****i
发帖数: 2346 | 4 我们用的就是第一种方法，蛮好的，我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的
所有sequence都被methylated了也无所谓，转到细胞内以后只关心我的promoter和
luciferase的转录表达，其余backbone上的序列不要也无所谓，有没有转录表达没关系
。再说你肯定要做一个control。
第二种方法看上去确实是更严谨，但是我个人认为和luciferase转录表达有关的，来自
plasmid的只有promoter和后面的polyA了，不一定对啊。
如果你实在不放心可以去要这个质粒：(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
响。
http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL |
b**********8
发帖数: 349 | 5 体外甲基化修饰后的质粒是直接用来转染细胞的，不用做转化和质粒抽提，应该不用考
虑抗性丢失的问题了吧？ Anyway， thanks a lot！
【在 s******s 的大作中提到】
: 第一种太糙了，估计其他抗性啥的都不表达了。
: 你为什么不去问paper的author
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b**********8
发帖数: 349 | 6 多谢回复，你提供的信息对我实在太有用了，thanks a lot
【在 d****i 的大作中提到】
: 我们用的就是第一种方法，蛮好的，我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的
: 所有sequence都被methylated了也无所谓，转到细胞内以后只关心我的promoter和
: luciferase的转录表达，其余backbone上的序列不要也无所谓，有没有转录表达没关系
: 。再说你肯定要做一个control。
: 第二种方法看上去确实是更严谨，但是我个人认为和luciferase转录表达有关的，来自
: plasmid的只有promoter和后面的polyA了，不一定对啊。
: 如果你实在不放心可以去要这个质粒：(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
: 潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
: 响。
: http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL
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