c***y
发帖数: 615 | 1 3'端的报道好象很少。最近把一段3'段序列连到luciferase 3'端，与相应的转录因子
共同转化细胞，好像还确实影响luciferase 的表达。该怎样分析可能的机制？多谢 |
d**p
发帖数: 149 | 2 3' UTR contain sequence which can interact with mRNA binding proteins. These
interaction may affect splicing and the mRNA localization.
【在 c***y 的大作中提到】
: 3'端的报道好象很少。最近把一段3'段序列连到luciferase 3'端，与相应的转录因子
: 共同转化细胞，好像还确实影响luciferase 的表达。该怎样分析可能的机制？多谢
|
Z******5
发帖数: 435 | 3 应该是增强子吧。 不一定要连到luciferase的3'端，很多位置都可以。 |
p****p
发帖数: 3360 | 4 实验和control的DNA constructs具体怎么建的？luciferase assay都有哪些control？
结果怎样？否则不好泛泛而谈。有可能如你所说的转录水平的调控，或者mRNA
processing的。影响mRNA结构/mRNA processing本身也会影响转录。
【在 c***y 的大作中提到】
: 3'端的报道好象很少。最近把一段3'段序列连到luciferase 3'端，与相应的转录因子
: 共同转化细胞，好像还确实影响luciferase 的表达。该怎样分析可能的机制？多谢
|
c***y
发帖数: 615 | 5 转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
pGL4.74, HSV-TK-Renilla
control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
24-3'DNA 和 pCMV
结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luciferase
reading 3-4倍；
还有那些control可以建议以下？ 多谢。相关的文献推荐以下更好，我自己也在查，只
是越查越觉得这种报道很少，对结论的疑虑也越严重。
【在 p****p 的大作中提到】
: 实验和control的DNA constructs具体怎么建的？luciferase assay都有哪些control？
: 结果怎样？否则不好泛泛而谈。有可能如你所说的转录水平的调控，或者mRNA
: processing的。影响mRNA结构/mRNA processing本身也会影响转录。
|
j****x
发帖数: 1704 | 6 TF binding sequence明确吗？
12
pGL4.
【在 c***y 的大作中提到】
: 转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
: 端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
: 和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
: promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
: pGL4.74, HSV-TK-Renilla
: control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
: TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
: 24-3'DNA 和 pCMV
: 结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luciferase
: reading 3-4倍；
|
c***y
发帖数: 615 | 7 in vitro 实验 鉴定了一个 consensus sequence
这里的3'端序列恰巧是含有这个consensus sequence的
【在 j****x 的大作中提到】
: TF binding sequence明确吗？
:
: 12
: pGL4.
|
c***y
发帖数: 615 | 8 需要补充的是，在类外的物种中，这个consensus sequence 主要位于5' 位点 (ChiP
数据)；换了我的，都跑到intron 或 3' 端了 （ in vitro genomic selection）.
test这个3'端的,是觉得构建luciferase construct的思路清晰些
【在 c***y 的大作中提到】
: in vitro 实验 鉴定了一个 consensus sequence
: 这里的3'端序列恰巧是含有这个consensus sequence的
|
p****p
发帖数: 3360 | 9 我的建议是再做一个pGL4.24-3'DNA的mutant construct，reshuffle 3'DNA片段中这个
TF的putative binding site。用这个mutant construct来代替 你的pCMV-TF和pGL4.24
cotransfection中的pGL4.24。理由还是3'DNA插入到pGL4.24会影响mRNA的结构从而影
响level，所以我觉得用pGL4.24本身做pGL4.24-3'DNA的negative control不合适。
12
paCMV-
pGL4.
【在 c***y 的大作中提到】
: 转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
: 端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
: 和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
: promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
: pGL4.74, HSV-TK-Renilla
: control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
: TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
: 24-3'DNA 和 pCMV
: 结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luciferase
: reading 3-4倍；
|
p****p
发帖数: 3360 | 10 由于TF的结合位点consensus都很短，in vitro selection很容易出假阳性。可以考虑
用chip-seq来做in vivo的。
【在 c***y 的大作中提到】
: 需要补充的是，在类外的物种中，这个consensus sequence 主要位于5' 位点 (ChiP
: 数据)；换了我的，都跑到intron 或 3' 端了 （ in vitro genomic selection）.
: test这个3'端的,是觉得构建luciferase construct的思路清晰些
|
|
|
c***y
发帖数: 615 | 11 谢谢回复。能详细讲一下reshuffle的具体设计方案吗？你是担心任何3'端的插入片断
都会影响luciferase level?
我其实test 了3个不同的in vitro selection products ( 序列完全不同，但长度在
100-200bp), luciferase reading （after normalized with against Renilla
reading） 分别是：0.6, 1.35, 1.1 (control reading 是0.39)
24
【在 p****p 的大作中提到】
: 我的建议是再做一个pGL4.24-3'DNA的mutant construct，reshuffle 3'DNA片段中这个
: TF的putative binding site。用这个mutant construct来代替 你的pCMV-TF和pGL4.24
: cotransfection中的pGL4.24。理由还是3'DNA插入到pGL4.24会影响mRNA的结构从而影
: 响level，所以我觉得用pGL4.24本身做pGL4.24-3'DNA的negative control不合适。
:
: 12
: paCMV-
: pGL4.
|
c***y
发帖数: 615 | 12 最初设计实验时的确在chip-seq 和 in vitro 之间犹豫过。主要是觉得Chip可能会
fish一些co-factor 的binding 序列。后来选择了 in vitro genomic selection,虽然
是in vitro,不过觉得有genomic background， 目的还是obtain a small but
significant sequence group; 出乎意料的是 location, 没有5'端或first intron 的
【在 p****p 的大作中提到】
: 由于TF的结合位点consensus都很短，in vitro selection很容易出假阳性。可以考虑
: 用chip-seq来做in vivo的。
|
p****p
发帖数: 3360 | 13 如果3’DNA插入到luciferase的polyA signal之前，我想影响mRNA稳定性、processing
的可能性就大多了。
我说reshuffle的意思就是把consensus里面的几个Nt混一混，倒一倒，最终目的就是破
坏consensus但不影响长度。
【在 c***y 的大作中提到】
: 谢谢回复。能详细讲一下reshuffle的具体设计方案吗？你是担心任何3'端的插入片断
: 都会影响luciferase level?
: 我其实test 了3个不同的in vitro selection products ( 序列完全不同，但长度在
: 100-200bp), luciferase reading （after normalized with against Renilla
: reading） 分别是：0.6, 1.35, 1.1 (control reading 是0.39)
:
: 24
|
c***y
发帖数: 615 | 14 又做了一些实验，有了新的结果，所以想再听听意见。
鉴于有些cis-regulatory elements是多个基因共享的，所以同时检测了一下它在
luciferase 5'end 的效应。结果是，无论它在5'end 还是3'end, 都增强luciferase的
表达。
由于这个片段(长约250bp)含有转录因子的consensus(8bp)序列，所以做了个deletion
突变，去掉这个consensus序列。再去检测luciferase的活性，发现如果片段位于
luciferase 5'end, 突变后luciferase活性降低到只有原来的 20%；这应该是个好结果
，因为证明了5'end端的增强基因表达作用确实是由转录因子介导的。
奇怪的是，如果片段位于luciferase 3'end, 突变好像对luciferase的活性没影响。
该怎样这样的矛盾结果？
processing
【在 p****p 的大作中提到】
: 如果3’DNA插入到luciferase的polyA signal之前，我想影响mRNA稳定性、processing
: 的可能性就大多了。
: 我说reshuffle的意思就是把consensus里面的几个Nt混一混，倒一倒，最终目的就是破
: 坏consensus但不影响长度。
|
c***y
发帖数: 615 | 15 没人能给点思路吗？
【在 c***y 的大作中提到】
: 谢谢回复。能详细讲一下reshuffle的具体设计方案吗？你是担心任何3'端的插入片断
: 都会影响luciferase level?
: 我其实test 了3个不同的in vitro selection products ( 序列完全不同，但长度在
: 100-200bp), luciferase reading （after normalized with against Renilla
: reading） 分别是：0.6, 1.35, 1.1 (control reading 是0.39)
:
: 24
|
