q**********0
发帖数: 335 | 1 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
)的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
transfection efficiency consistency更好？ |
m******5
发帖数: 1383 | 2 我也不大懂这个系统，借地问两句，听说现在有一种说法是这种实验如果作为主体很容
易被打回来，因为不是很科学的系统。 好文章现在这种实验都是藏在一个小pannel里
佐证一下 |
q**********0
发帖数: 335 | 3 我自己的切身体会也感觉到这个系统不科学，首先就不能保证几个plasmids进入同一个
细胞。
【在 m******5 的大作中提到】
: 我也不大懂这个系统，借地问两句，听说现在有一种说法是这种实验如果作为主体很容
: 易被打回来，因为不是很科学的系统。 好文章现在这种实验都是藏在一个小pannel里
: 佐证一下
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b**********8
发帖数: 349 | 4 顶楼主，我做dual luciferase reporter好久了，也碰到跟你一模一样的问题。我感觉
这套系统真的很不stable，因此不是很reliable，那些通过dual luciferase reporter
就能找到一个关键的cis elenmentary sequences的paper，让我看的好生羡慕和佩服啊
，我自己做promoter和3‘UTR的dual luciferase reporter，出来的数据从来都是忽高
忽低的，就算有差异，也只有40%左右，根本做不到人家paper上的那么significantly
。 |
q**********0
发帖数: 335 | 5 说实话,我现在就是在重复一个paper的结果,用的是一模一样的试验系统(除培养基
brand),但就是重复不出来,我的也是忽高忽低,一点也不consistency.真是纳闷的很呢,
请这方面有经验的高人指导一下吧,怎样做出稳定的数据呢?
reporter
significantly
【在 b**********8 的大作中提到】
: 顶楼主，我做dual luciferase reporter好久了，也碰到跟你一模一样的问题。我感觉
: 这套系统真的很不stable，因此不是很reliable，那些通过dual luciferase reporter
: 就能找到一个关键的cis elenmentary sequences的paper，让我看的好生羡慕和佩服啊
: ，我自己做promoter和3‘UTR的dual luciferase reporter，出来的数据从来都是忽高
: 忽低的，就算有差异，也只有40%左右，根本做不到人家paper上的那么significantly
: 。
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z********i
发帖数: 610 | 6 我们主要是做细胞方面的东西，reporter assay也做的比较多，经常会遇到你说的这种
情况，我个人觉得是transfection的影响，就是用空质粒补平了，也会出现。有这种情
况，在转染试剂一定量得情况下，共转两个质粒，一个质粒单转+空载体补平，你会发
现共转的表达强。
所以需要用其它的质粒去normalize。一般这种实验不是主要data，重复几次结果一致
就可以了。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
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z********i
发帖数: 610 | 7 你可以做IF染色看一下就知道了，基本上都是共转的，虽然其中的原理并不知道，所以
这个问题不用担心。
我们做stable cell lines的时候，载体上并没有抗性基因，就是共转一个抗性基因，
然后用药去筛，挑几个克隆，90%以上的都能表达。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 我自己的切身体会也感觉到这个系统不科学，首先就不能保证几个plasmids进入同一个
: 细胞。
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B******o
发帖数: 496 | 8 我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
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b**********8
发帖数: 349 | 9
你这个方法也是解决问题的一个办法，不过如果表达的外源蛋白对细胞的增殖有影响的
话，最终导致细胞数不一致，所以提取的总蛋白量也不一致，这样还可以来做
normalization吗？另外你这里说的蛋白量是蛋白浓度吗？还是其他？
【在 B******o 的大作中提到】
: 我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
: ，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
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B******o
发帖数: 496 | 10 第一次转染的时候用的reporter plasmid，reseed时候所有well里已经转染的细胞数是
一致的。第二次转染的时候再转你的transcription factor，即使它会促进细胞增殖，
我觉得不会对结果有多大影响，毕竟你的TF如果activate luciferase expression，差
别那是相当大(suppose你24 or 48hr收样品).细胞增殖的过程实际是你的vector在细胞
里被稀释过程，按照你的说法control background luciferase是应该降低的，如果在
这种情况下你能看到明显的activation，那一定是真的对吧
normalization可以用蛋白浓度(前提是上一样的量),和用上样的总蛋白量其实是一样的
道理
只是俺的拙见
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 你这个方法也是解决问题的一个办法，不过如果表达的外源蛋白对细胞的增殖有影响的
: 话，最终导致细胞数不一致，所以提取的总蛋白量也不一致，这样还可以来做
: normalization吗？另外你这里说的蛋白量是蛋白浓度吗？还是其他？
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q**********0
发帖数: 335 | 11 谢谢回复！我也正想作个IF试试，只是很好奇，为什么所有plasmid倾向进入同一个细
胞。
【在 z********i 的大作中提到】
: 你可以做IF染色看一下就知道了，基本上都是共转的，虽然其中的原理并不知道，所以
: 这个问题不用担心。
: 我们做stable cell lines的时候，载体上并没有抗性基因，就是共转一个抗性基因，
: 然后用药去筛，挑几个克隆，90%以上的都能表达。
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q**********0
发帖数: 335 | 12 谢谢回复！如果先将报告基因转染，在reseed细胞时，该plasmid可能会丢失的，又怎
么能观察到目的蛋白对报告基因启动子的影响呢?况且如果不同时转染的话，怎么能保
证两个plasmids进入同一个细胞呢？
【在 B******o 的大作中提到】
: 我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
: ，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
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r*****d
发帖数: 366 | 13 我也被同样的问题困扰。。
我不用转染TF,只是加药。。结果加了药以后renilla的读数成比例的上升，导致
firefly/renilla的比例还是不变甚至下降。我看到有些CELL paper,就直接做firefly,
不做renilla...
但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低
【在 q**********0 的大作中提到】
: 谢谢回复！如果先将报告基因转染，在reseed细胞时，该plasmid可能会丢失的，又怎
: 么能观察到目的蛋白对报告基因启动子的影响呢?况且如果不同时转染的话，怎么能保
: 证两个plasmids进入同一个细胞呢？
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W***9
发帖数: 4834 | 14 use B=gal as control
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
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w*********e
发帖数: 98 | 15 我前段时间刚遇到过同样的问题。换成CMV promoter的renilla 会好很多。个人认为
我们研究的蛋白对TK promoter 有一定的特异激活作用。希望对你有帮助。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
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f********n
发帖数: 6465 | 16 我做过一次，制备了个稳定转染的细胞系（REPORT和目的质粒双转染）。
问题是只能用很短时间，然后数据就误差很大很大了。
是不是双转染不稳定，只能维持很短时间呢？ |
y****6
发帖数: 196 | 17 Use CMV-gal as control. |
q**********0
发帖数: 335 | 18 谢谢以上各位的回复。我也正想用CMV-Reilla试试，希望它不受目的蛋白的影响。
我们转染的目的蛋白和报告基因都是瞬时表达体系，不会整合进宿主基因。所以变异可
能还来自实验系统本身。对于稳定转染的细胞系，是否转染的目的蛋白和报告基因已经
丢失掉？ |
