f*****n
发帖数: 499 | 1 研究noncoding序列，因为各种原因无法使用dual luciferase；所以想直接用single
luciferase（比如Renilla）
问题是，对于single luciferase应该如何对照才有说服力呢？翻了半天过去的文献都
没找到
我能想到的一个是细胞使用量，这个用GAPDH就可以control
还有一个就是转染的plasmid的量，这个我转染的时候保证同样molar的就是同样数量的
plasmid进入细胞；具体做法就是nanodrop测得plasmid的质量，然后除以分子量。请问
这样的做法大家买账吗？
谢谢 |
S**********e
发帖数: 620 | 2 为什么不能双荧光？洗耳恭听
【在 f*****n 的大作中提到】
: 研究noncoding序列，因为各种原因无法使用dual luciferase；所以想直接用single
: luciferase（比如Renilla）
: 问题是，对于single luciferase应该如何对照才有说服力呢？翻了半天过去的文献都
: 没找到
: 我能想到的一个是细胞使用量，这个用GAPDH就可以control
: 还有一个就是转染的plasmid的量，这个我转染的时候保证同样molar的就是同样数量的
: plasmid进入细胞；具体做法就是nanodrop测得plasmid的质量，然后除以分子量。请问
: 这样的做法大家买账吗？
: 谢谢
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m*********D
发帖数: 1727 | 3 几个值得考虑的方式：
1。transfect a pool，然后再split，每个treatment分开作。
2。Stable cell lines--可以是一个pool（排除integration site问题），或几个不同
的克隆。
3。除了Dual-luc，还有其它co-transfect的reporter,如laz,或者一个不相关的
protein，用western来定量。 |
f*****n
发帖数: 499 | 4 我用的是psicheck-2的质粒，就是Renilla和Firefly在同一个plasmid上。Renilla是
control
我研究的这段noncoding序列有复杂的secondary structure，而且大概2kb，所以很可
能这样的序列会影响整个psicheck-2的空间结构和表达，包括作为internal control的
Renilla。
psicheck-2-noncoding-SNP-A和psicheck-2-noncoding-SNP-B，每次我用相同量的质粒
，相同数量的细胞转染，这个internal control的Renilla总是有明显差别；所以觉得
这里的control是没用的，但同时也说明在转录水平SNP-A和B有差别。
所以我的问题是：
1. 还是用这套系统，但我做RNA level的qPCR，我用GAPDH来控制细胞数量，同时我保
证转染加入的plasmid是相
同的量，那么我做出来的表达差别是否可信？可否发表？
2. 当然我可以重新找一个single Renilla vector，把noncoding插到这个vector上，
然后co-transfect一个独立的另外Firefly control。关于这个single vector，有经验
的前辈们是否有啥推荐？
谢谢
【在 S**********e 的大作中提到】
: 为什么不能双荧光？洗耳恭听
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f*****n
发帖数: 499 | 5 transfect a pool，然后再split？
请教这是啥意思？我每次6-well plate都转染2ug，然后收细胞的时候都分成三份，进
行实验。是这个意思吗？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 几个值得考虑的方式：
: 1。transfect a pool，然后再split，每个treatment分开作。
: 2。Stable cell lines--可以是一个pool（排除integration site问题），或几个不同
: 的克隆。
: 3。除了Dual-luc，还有其它co-transfect的reporter,如laz,或者一个不相关的
: protein，用western来定量。
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