Z******5
发帖数: 435 | 1 听说EGFP观察更容易，不需要加底物。但问题是需要激发光，老鼠的自发荧光会有干扰
。虽然EGFP灵敏度比Luciferase高，但是有本底的干扰导致实际灵敏度还不如
Luciferase。
Luciferase好处是可以定量，不受自发荧光干扰。但是观察前需要腹腔或者血液注射底
物。据说灵敏度可以达到100个细胞，然后随着距离体表的深度每增加0.5cm，检测的灵
敏度升高一个数量级的细胞数。
两者可以说各有优缺点。总体感觉luciferase可能更好。但是发表出来的论文中貌似转
基因的多数都是EGFP标记，而luciferase大多是用来标记打入老鼠的外源肿瘤细胞。
这方面没啥经验，请有经验的朋友给个建议。 |
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h*****G
发帖数: 113 | 2 小弟不才，被老板要求做luciferase assay测一个promoter的mutation对基因表达的影
响。
因为以前没有做过，所以向各位有经验的大侠请教，希望不吝赐教。
问题1:
luciferase assay和GFP相比有什么优势啊？如果直接在promoter后面接一个GFP，直接
FACS看GFP的表达不也可以看基因表达的变化，而且还不用任何特别的试剂盒。
问题2:
看了Thermo fisher网站上的信息，有不同版本的luciferase。比如firefly
luciferase只能表达在细胞内，需要细胞lysate，然后加入luciferin，ATP等才能测发
光。 而一些其它的版本，比如Gaussia Luciferase，可以直接分泌到media，这样不用
提lysate，可以直接测发光，方便多了，为什么还有很多实验都用的firefly的呢？
多谢指教！ |
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X***n
发帖数: 366 | 3 如果想看一段序列是否包含promoter，把这段序列克隆到luciferase上游看看能否
activate luciferase expression. 如果想看你design的shRNA能否work，把你的靶序
列克隆到luciferase的3'-UTR. microRNA同理。 |
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t**********n
发帖数: 283 | 4 Many thanks.
As for the control, we have a paralled transfection with GFP plasmid, whose
expression is low while positive.
Renilla readouts are 2~4，evan using different amount of plasmid, which is
almost same as the blank(就是96孔板上啥也没有的wells).
Luciferase readouts are 8~12( expected as negative).
We just had another experiment: luciferase readouts ~60, expected as
positive while Renilla readouts 8~11.
Not sure whether I expressed myself clearly or not.
is
3
his
worry |
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发帖数: 1 | 5 研究noncoding序列，因为各种原因无法使用dual luciferase；所以想直接用single
luciferase（比如Renilla）
问题是，对于single luciferase应该如何对照才有说服力呢？翻了半天过去的文献都
没找到
我能想到的一个是细胞使用量，这个用GAPDH就可以control
还有一个就是转染的plasmid的量，这个我转染的时候保证同样molar的就是同样数量的
plasmid进入细胞；具体做法就是nanodrop测得plasmid的质量，然后除以分子量。请问
这样的做法大家买账吗？
谢谢 |
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C****b
发帖数: 90 | 6 Promega Luciferase Reporter Seminar
ICCBL Screening Facility will host the following Seminar presented by
Promega. If you're interested in attending, please click the link below for
free registration.
http://www.promega.com/Catalog/CountrySelect.aspx?returnurl=/seminars/registration.asp
Refreshments will be provided.
Understanding Luciferase Reporters
Wednesday December 2nd, 2009 in TMEC Room 446 from 10:00am - 1:00pm
Agenda
10:00am - Luciferase Reporter Assays: Applications Beyond Promoter Bash |
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n******u
发帖数: 418 | 8 以前做luciferase assay
control一般都是b-gal
但是最近新的一批实验发现gal的表达被overexpression的protein repress的很厉害
试过pAct-b gal和pCH110 b gal都是一样的情况
所以问一下，除了用renilla luciferase做control还有其他什么control可以尝试么？ |
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b*******0
发帖数: 507 | 9 很多实验室在用firefly luciferase作reporter gene,
谁知道firefly luciferase在mammalian cell中如何trafficking的？
COP II dependent or non-dependent?
查了很长时间，都没查到相关信息。 |
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b*******0
发帖数: 507 | 10 看到很多实验室用LUCIFERASE做报告基因来研究基因表达啊，肿瘤扩张之类的实验。但
有个问题不明白，如果检测到PHOTON FLUX对照是肿瘤组的2倍，应该不能证明肿瘤大小
就小了2倍吧？发觉LUCIFERASE的活性似乎很SENSITIVE，两组之间很小的一点差异，似
乎能造成很大的活性不同啊。这样的REPORTER又有啥意义呢？ |
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l******g
发帖数: 1145 | 11 putative target的3UTR已经克隆进psicheck-2了，打算用promega的dual luciferase
来检测。
查了一下发现有两种，一个是DLR，还有一个是dual－glo luciferase。理论上dual-
glo的荧光信号更稳定，得到的数据应该更可靠。不过我查了一下文献，发现很多CNS的
牛文章，用的都是DLR的哪种。
请问是这是因为dual-glo刚出来不久，用的人还不多呢？还是dual-glo实际运用中存在
问题？
多谢多谢～ |
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c******a
发帖数: 267 | 12 是的，做过的估计都会觉得10倍的增加太少了，尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
处理多长时间以后测的luciferase activity.
qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了，比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
类的
另外，IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。 |
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t**********n
发帖数: 283 | 13 We just had another experiment: luciferase readouts ~60, expected as
positive while Renilla readouts 8~11.---那这个是不是表示转上了？？
谢谢！ |
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F******p
发帖数: 2099 | 14 没转上，或者说<1%的efficiency.
luciferase这种report都是至少3位数基本的读数。 |
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m****r
发帖数: 383 | 15 想改造一个tumor cell line, 加上荧光标记，以后打老鼠，可以用来看tumor
formation, 以及收集起来做flow cytometry。犹豫用什么tag 好。GFP 还是
luciferase, 或者其他？谢啦。 |
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m****r
发帖数: 383 | 16 自己顶一下。
我查了查，初步印象是，GFP荧光相对弱，不太适合用来观察deep tissue的tumor.但是
表达luciferase的tumor cell似乎不适合用来做flow cytometry,因为加底物luciferin
可能会破坏细胞。谁有经验么？ |
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o*****a
发帖数: 2335 | 17 俺刚看的一个文章同时用Luciferase和DsRed2 |
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m****r
发帖数: 383 | 18 能给个文章的链接么？谢啦。
我也刚看到有公司卖luciferase and tomota双标记的，死贵，3000多刀。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 You should use Tdtomato, because it is bright and because it avoid most of
the intrinsic fluorescence (which is kind of green).
I won't use luciferase because it is hard to get the substrate to penetrate
the cell. |
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m****r
发帖数: 383 | 20 Thank you. I am thinking to use both. luciferase for detecting tumors in
deep tissues, and Tdtomoto for flow cytometry.
penetrate |
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n**********1
发帖数: 251 | 21 谁能简单和我说说Luciferase的应用啊多谢！
简单的说说原理和在分子生物学里面常见的应用，看了一些文献但是没有完全看懂
原理，有经验的人说说，多谢了啊！ |
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r****m
发帖数: 46 | 22 luferase基因就是report啊
有现成的vector卖
做成质粒就可以用了
不过还要买配套的luciferase的检测试剂 |
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n**********1
发帖数: 251 | 23 谁能简单和我说说Luciferase的应用啊多谢！
简单的说说原理和在分子生物学里面常见的应用，看了一些文献但是没有完全看懂
原理，有经验的人说说，多谢了啊！ |
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n**********1
发帖数: 251 | 24
有点懂了，那是不是luciferase就像GFP蛋白一样，通过外源性的序列，比如promoter
去启动它，或者通过shRNA去移植它，它就像一个指标一样，比较容易检测到啊？然后
就提示外源性序列的作用和活性啊？ |
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X***n
发帖数: 366 | 25 GFP发光是fluorescence，是光致发光，激发光将荧光发色团从单线态激发到高能的三
线态，三线态不稳定，返回单线态，发射出荧光。
Luciferase发光是chemiluminascence,是化学发光，发光基团吸收来自化学反应的能量
，以光的形式释放能量，回到低能态，是化学发光。
promoter |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 Yes, almost just like that.
Except that luciferase has different luminescent mechanism
promoter |
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h********u
发帖数: 11 | 27 我做了好多次，也很用心去做，但是发现重现性很不好。
请教班上大牛解释一下。
我做的是 dual luciferase assay, 同一组细胞差别挺大的，用fugene 6 转染然后刺
激。但是看发表文章的都是差别特别小，我真的不知道我到底哪里错了。 |
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L**********O
发帖数: 1761 | 28 no. Dual Luciferase Assay |
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m******5
发帖数: 1383 | 29 问个笼统的问题
在cRNA microarray raw data差别极高的情况下， 如chontrol 10000 treated 30000
这样的数据真实度有多少？在qPCR中能指望看到多少差异？在luciferase promoter
assay中呢？
另外，如果差异是在transient express某个目的基因后得到的，大家通常如何把
transfect efficiency normalize到fold change中呢？直接做乘法？ |
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m**********d
发帖数: 137 | 30 对一个gene感兴趣，请问哪家公司可以买到做好的gene promoter luciferase
reporter plasmid? 多谢 |
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k****f
发帖数: 29 | 31 在测luc时，promega的protocal上说要对于96孔板来说，加75ul luciferase reagent.
但老板说太多，这个试剂贵。她说家少点，那我加20ul在75ul cell lysis 中可以吗？
试过预实验，貌似还行，但有点不确定，所以问一下有经验的大侠撒
谢谢！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 32 用Tecan M1000 plate reader测firefly luciferase的luminescence，
要用的plate是不是跟fluorescence或ELISA的plate都不同？麻烦给个cat no.?
多谢！ |
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b******e
发帖数: 3348 | 33 就是用promega PLB buffer做了cell lysate以后，不知道这种情况下luciferase是不
是很不稳定？ |
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z*******2
发帖数: 658 | 34 各位老大，在下请问若表达firefly lucifease，多小的firefly lucifease 片段仍有
luciferase 活性。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 35 luciferase:Cre fusion protein存在吗? 我搜了半天, 只看到Cre:GFP.
谁给指点一下? |
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a*****i
发帖数: 1045 | 36 如果transfection的效率特别低，是不是测出来的值就不准确呢？
如果要比较两个transcription facotr, 谁activate那个特定的promoter 多一点。
但是其中有一个的transfection efficiency总是特别低，但是却发现这个
transcription factor可以更多的activate那个promoter。。。
我已经用了renilla luciferase作为检测transfection 效率的。
这种情况是什么意思呢？有没有懂得帮忙看看呢？
谢谢啦 |
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a*****i
发帖数: 1045 | 37 对的，是和promoter一起的。我的转染效率已经用renila luciferase correct过了。
所以我也搞不懂，还是做个chip看看是否有binding吧 |
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h********n
发帖数: 4079 | 38 谁给推荐一个firefly luciferase的抗体, 用来老鼠组织的immunofluorescent.
谢谢谢谢. |
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Y*****e
发帖数: 9 | 39 Mouse anti-luciferase monoclonal antibody from Sigma (Cat#: L2164-.2ML
), try 1:200 dilution for IHC or IF. Use 1:400 or higher dilution for
western |
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l******n
发帖数: 298 | 40 一个基因的dual luciferase assay, 刺激以后有10倍的激活，非常兴奋。从-2000一直
都砍到-100了，还是10倍的激活，一点也没减少，这是什么原因呢？
还有就是renilla-cmv好像也能被调控，有这么一说吗？
望高手指点 |
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S*********s
发帖数: 304 | 41 可能性太多。
有一种可能性就是刺激了general transcription.
另外，luciferase assay本身就是不是太靠谱，最好有其他assay来confirm. |
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f*******d
发帖数: 92 | 42 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
DNA 序列会跟这个r... 阅读全帖 |
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S*********s
发帖数: 304 | 43 我觉得你luciferase assay有问题。
一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
According to 某免疫大牛，<10 fold的他们认为太trivial
可以QPCR做几个下游的基因看看
另外如果真的觉得有变化，不妨做RNASeq or array.
biotin
treatment
EMSA |
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f*******d
发帖数: 92 | 44 多谢！那为啥做EMSA的序列和做luciferase reporter的序列不一样呢～ |
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Z******5
发帖数: 435 | 45 这两种荧光蛋白的检测机器我们动物房都有
要在C57老鼠里过表达一个基因，rtTA诱导的，然后和手头的MMTV-Cre老鼠杂交实现乳
腺组织特异性表达，看老鼠自发乳腺癌是否会增多。
现在想在基因后面加一个IRES-EGFP，或者IRES-Luciferase， 用来指示目的基因的过
表达情况。不知道加哪个好。 |
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q******g
发帖数: 3858 | 46 我也不太懂，随便说一下。
我想你需要观察动物的乳腺，看该蛋白是否有表达。
如果你有红色的荧光蛋白，mCherry, Tomato之类的，肯定不存在自发荧光干扰得问题
。这应该是最好的选择。
但考虑到你看的自发乳腺癌，离表皮比较近， 或许干扰比较小。这你需要查下文献。
luciferase用于活体观察没有问题。但如果你想分离乳腺细胞，做流式细胞仪分析，可
能荧光蛋白更好。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 47
太强了！有这个最好。如果没有，需要分离细胞或者tissue用GFP，需要活体动物水平
观察，建议用luciferase。 |
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i*********g
发帖数: 1940 | 48 Promoter Region和Luciferase DNA 怎么连接？ 有什么Protocol或手册指导没有？
谢谢 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 49 最近作split GFP， 发现荧光很低，同样的GFP质粒转染到293细胞里有很强的荧光信号
并且很夸张的cell pellet是绿色的。
记得有人说过split GFP 成熟很慢。
LUCIFERASE 好些。有高手给点建议吗？ |
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j*****n
发帖数: 135 | 50 换venus，比GFP成熟快，荧光强。split luciferase主要是有一步酶反应所以read-out
高。 |
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