g******1
发帖数: 244 | 1 在新实验室第一次做RT-PCR，用的是实验室传下来的protocol。
oligoT作RT以后再用cDNA扩增，使用200bp左右产物的primer sets扩增，3组全部扩出
产物；但是
同一个基因，1kb左右产物的primer set就扩不出来。因为有正负对照，知道PCR体系和
引物没问题。
但是试了很多次，包括使用其他基因的引物，都是括不出大片段。
这是什么情况？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 很可能是你提RNA的时候有部分降解，导致没有足够长的底物。
【在 g******1 的大作中提到】
: 在新实验室第一次做RT-PCR，用的是实验室传下来的protocol。
: oligoT作RT以后再用cDNA扩增，使用200bp左右产物的primer sets扩增，3组全部扩出
: 产物；但是
: 同一个基因，1kb左右产物的primer set就扩不出来。因为有正负对照，知道PCR体系和
: 引物没问题。
: 但是试了很多次，包括使用其他基因的引物，都是括不出大片段。
: 这是什么情况？
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S*******m
发帖数: 34 | 3 加RNaseH处理样品了没有?扩长一点片段需要处理.短的没有必要.
【在 g******1 的大作中提到】
: 在新实验室第一次做RT-PCR，用的是实验室传下来的protocol。
: oligoT作RT以后再用cDNA扩增，使用200bp左右产物的primer sets扩增，3组全部扩出
: 产物；但是
: 同一个基因，1kb左右产物的primer set就扩不出来。因为有正负对照，知道PCR体系和
: 引物没问题。
: 但是试了很多次，包括使用其他基因的引物，都是括不出大片段。
: 这是什么情况？
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g******1
发帖数: 244 | 4 以前从不加RNAse，扩增2kb也没问题啊。
倒是确实不排除RNA降解的可能性
【在 S*******m 的大作中提到】
: 加RNaseH处理样品了没有?扩长一点片段需要处理.短的没有必要.
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S*******m
发帖数: 34 | 5 有可能.还是建议你从最简单的地方开始排查.
【在 g******1 的大作中提到】
: 以前从不加RNAse，扩增2kb也没问题啊。
: 倒是确实不排除RNA降解的可能性
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g******1
发帖数: 244 | 6 更新：跑了个琼脂糖电泳，28S 和18S条带很清楚，有少量Smear。但是5S最亮，18S 看
起来比28S亮一点。这是不是跟降解有关？ |
w******e
发帖数: 1187 | 7 28s:18s should be 2:1 I believe?
【在 g******1 的大作中提到】
: 更新：跑了个琼脂糖电泳，28S 和18S条带很清楚，有少量Smear。但是5S最亮，18S 看
: 起来比28S亮一点。这是不是跟降解有关？
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g******1
发帖数: 244 | |
s******y
发帖数: 28562 | 9 Well, you should add RNaseH. Because sometimes you never know what kind of
strange conformation those double-strand DNA-RNA can be.
They can easily inhibit your PCR reaction.
I would also suggest you to increase the template amount, and on the
meantime, try to do the RT-PCR again carefully.
【在 g******1 的大作中提到】
: 以前从不加RNAse，扩增2kb也没问题啊。
: 倒是确实不排除RNA降解的可能性
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s******y
发帖数: 28562 | 10 Yes, because those rRNA would not form dimer with each other
【在 g******1 的大作中提到】
: 不知道非变形胶中是不是仍然适用2：1比例
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g******1
发帖数: 244 | |
