S**********e
发帖数: 1789 | 1 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
？大家怎么解决这个问题的。
Happy Holiday! |
n********k
发帖数: 2818 | 2 either too confluent, or you didn't handle with care...or your cells have
been too old etc...Make sure you cells
are fine and then handle with care, never overgrow them...Alternative, coat
plates with poly-Lysine, still never
overgrow the cells...
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
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l********e
发帖数: 636 | 3 应该你操作不小心，细胞可能状态不好， 不过 和上面说的想反， 如果你细胞过少的
话， 也容易脱。 |
r***e
发帖数: 2539 | 4 coating很管用，你用什么方法转啊？
转之前不换液就不会掉了。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
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n********k
发帖数: 2818 | 5 with non-coated plates, unless very experienced and careful, never change
medium right before the
transfection, the cells will cluster and decrease efficiency...could change
the medium 6-12 hrs before hand...
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
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S**********e
发帖数: 1789 | 6 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
吗？
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
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S**********e
发帖数: 1789 | 7 请问怎么coating, 我没做过。请指教。
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
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n********k
发帖数: 2818 | 8 Antibotics is not really a big concern...
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
: 还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
: 吗？
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r***e
发帖数: 2539 | 9 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
加培养液和细胞。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
: 还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
: 吗？
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S**********e
发帖数: 1789 | 10 谢谢。去core lab看看有没有poly-Lysine, 买一瓶。用无菌水稀释吗？
【在 r***e 的大作中提到】
: 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
: 买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
: 加培养液和细胞。
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r***e
发帖数: 2539 | 11 一般都是PBS吧。
其实病毒生成以后，细胞也容易漂，所以coating以后是一举两得。你做过就知道了。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 谢谢。去core lab看看有没有poly-Lysine, 买一瓶。用无菌水稀释吗？
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S**********e
发帖数: 1789 | 12 再请教一下，是poly-D-Lysine 还是poly-L-Lysine?
【在 r***e 的大作中提到】
: 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
: 买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
: 加培养液和细胞。
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a****d
发帖数: 1919 | 13 I coated the plates with gelatin/PBS to prevent cells detaching. If you
handle the cells carefully enough, you don't really have to coat the plates.
When you changing medium, do one plate per time, and don't try to change
medium for more than 3 plates in one shot. Cells don't like being exposed to
air for too long. Another thing is to, add medium or PBS to the wall but
not directly to the cells. |
G********e
发帖数: 528 | 14 我用过trypsin处理后的细胞悬液直接加LF的转染mix
没什么问题
我也用过带抗生素的media
也能有virus
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
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l********e
发帖数: 636 | 15 antibiotics does not matter if you use fugene6. I remember the company state
it in the protocol. |
S**********e
发帖数: 1789 | 16 看样子出病毒不太困难，说不定我的上清里也有病毒了。
Thanks all who replied and happy holiday!
【在 G********e 的大作中提到】
: 我用过trypsin处理后的细胞悬液直接加LF的转染mix
: 没什么问题
: 我也用过带抗生素的media
: 也能有virus
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Z******5
发帖数: 435 | 17 养了一年半细胞了，从来没有用过抗生素，也没有污染过。
另外我转染都用罗氏的FuGene HD，不用换液，操作简单。 我们实验室转293T的都用这
个。 |
