c****1
发帖数: 1095 | 1 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？ |
t******k
发帖数: 599 | |
a*****n
发帖数: 2835 | 3 也可以用别的不整合的virus
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
|
h******y
发帖数: 351 | 4 可以考虑用Cas9的mRNA
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
|
a*******a
发帖数: 4233 | 5 gRNA不用lenti不就行了
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
|
O*****l
发帖数: 97 | 6 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
|
d****i
发帖数: 2346 | 7 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
【在 O*****l 的大作中提到】
: 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
: ，KO效率还是很高的。
: 如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
: 整合效率不高。
|
G****s
发帖数: 249 | 8 Tet-on promoter does NOT work very well. |
O*****l
发帖数: 97 | 9 共转带Puro／GFP的质粒，用单个Crispr的1:4甚至更少，然后筛选。
【在 d****i 的大作中提到】
: 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
|
z*t
发帖数: 863 | 10 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
complex
这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
|
|
|
c****1
发帖数: 1095 | 11 具体怎么做？人工合成sgRNA，重组的Cas9?
有参考文献或者protocol么？多谢！！
effiency
【在 z*t 的大作中提到】
: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
: complex
: 这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
: 存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
|
z*t
发帖数: 863 | 12 我就一起说了哈，还有一个哥们问我
我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min
然后加到neon transfection打电转。
Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/geneart-
crispr/crispr-protein.html
下面是跟我们类似的protocol
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/
synthetic-biology/pdfs/Rapid%20and%20highly%20efficient%20mammalian%20cell%
20engineering%20via%20Cas9%20protein%20transfection%20PUBLICATION.pdf
【在 c****1 的大作中提到】
: 具体怎么做？人工合成sgRNA，重组的Cas9?
: 有参考文献或者protocol么？多谢！！
:
: effiency
|
l*****o
发帖数: 180 | 13 这帖子要mark
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
|
z*t
发帖数: 863 | 14 是不是得打赏包子的说，嘿嘿
【在 l*****o 的大作中提到】
: 这帖子要mark
|
b*****s
发帖数: 169 | 15 赞！
搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
谢谢！
geneart-
【在 z*t 的大作中提到】
: 我就一起说了哈，还有一个哥们问我
: 我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min
: 然后加到neon transfection打电转。
: Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product
: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/geneart-
: crispr/crispr-protein.html
: 下面是跟我们类似的protocol
: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/
: synthetic-biology/pdfs/Rapid%20and%20highly%20efficient%20mammalian%20cell%
: 20engineering%20via%20Cas9%20protein%20transfection%20PUBLICATION.pdf
|
z*t
发帖数: 863 | 16 inducible目前不好做
可以稳转Cas9+ inducible sgRNA，这个是目前我觉得最靠谱的.
至于inducible Cas9之前有兄弟说了不一定work，我们的经验是还会有Cas9的leakness.
【在 b*****s 的大作中提到】
: 赞！
: 搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
: 谢谢！
:
: geneart-
|
c****1
发帖数: 1095 | 17 非常感谢你的建议。我看了看这个，确实不错，准备试试。
请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
effiency
【在 z*t 的大作中提到】
: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
: complex
: 这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
: 存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
|
c****1
发帖数: 1095 | 18 两个包子已转。请查收。
【在 z*t 的大作中提到】
: 是不是得打赏包子的说，嘿嘿
|
m******o
发帖数: 8504 | 19 用PURO或者GFP筛选一下下，然后从剩下的里面的里面筛单克隆，效率还挺高的。不过
这都是建立在transfection效率还不错的基础上
【在 d****i 的大作中提到】
: 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
|
z*t
发帖数: 863 | 20 我们用的是wt cas9
【在 c****1 的大作中提到】
: 非常感谢你的建议。我看了看这个，确实不错，准备试试。
: 请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
:
: effiency
|
