l*******e
发帖数: 170 | 1 我现在在做一个抑癌基因，想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
interaction.
我知道有CRISPR的library，但没有实际经验，所以想找几篇相关文章看看
或者谁有实际经验传授一下也很感谢。 |
H****N
发帖数: 997 | |
m******g
发帖数: 467 | 3 Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair? |
C*********h
发帖数: 83 | 4 相关的paper好多篇
自己搜索一下就能发现。
经验还是很重要的。
早期的library把Cas9和gRNA放在一个载体上，导致病毒滴度太低。
所以最好用新的library.
【在 l*******e 的大作中提到】
: 我现在在做一个抑癌基因，想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
: interaction.
: 我知道有CRISPR的library，但没有实际经验，所以想找几篇相关文章看看
: 或者谁有实际经验传授一下也很感谢。
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D*a
发帖数: 6830 | 5 很多文章不是业内的也不一定知道到底靠谱不靠谱啊。再说了都是发CNS的或者没发CNS
的经典程度也不一样啊。
做过几个课题都应该有这个认识吧，pubmed当然是都在那儿摆着，但是有人带没人带，
入门的快慢不一样。
【在 H****N 的大作中提到】
: 为什么不是自己去查而是让别人告诉你？
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V******t
发帖数: 444 | 6 同求问。我正在做screen，原来是用Haploid 细胞＋piggyback 做forward genetic
screen
现在也打算用CRISPR。求科普＋八卦
【在 l*******e 的大作中提到】
: 我现在在做一个抑癌基因，想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
: interaction.
: 我知道有CRISPR的library，但没有实际经验，所以想找几篇相关文章看看
: 或者谁有实际经验传授一下也很感谢。
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d****u
发帖数: 1553 | 7 哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧，都在大牛杂志上呢。
至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上，根据我们的经验，目前最好用的是Zhang Feng
lab的version 2 all in one vector。
有几个实验室载体分开的，必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
的不同而异，我们用的是原代细胞，不见得有普遍性。
不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
从screen的角度来讲，crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高. |
V******t
发帖数: 444 | 8 那个nature biotechnology文章
我就是按照他的方法的library和cas9细胞
你说说看法吧
Feng
高.
【在 d****u 的大作中提到】
: 哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧，都在大牛杂志上呢。
: 至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上，根据我们的经验，目前最好用的是Zhang Feng
: lab的version 2 all in one vector。
: 有几个实验室载体分开的，必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
: 的不同而异，我们用的是原代细胞，不见得有普遍性。
: 不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
: 从screen的角度来讲，crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高.
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d****u
发帖数: 1553 | 9 有几篇呢，我不是很确定你具体指的哪一篇。我是按照Zhang lab那片science paper来
的。但是具体的protocol做了一些改变。那个时候他们的vector还是version 1. 病毒
的滴度在我们的细胞里还行，但是加多了会非特异性的杀细胞，所以感染的时候一定要
把MOI控制在比较低的水平。后来他们的version 2出来了，号称滴度增加10倍，但是在
我们的细胞里没看出有这么大的改善，但是在高MOI的时候对细胞的伤害不是那么大了
。从总体screen的质量来看，他们的library表现还是相当好的。
【在 V******t 的大作中提到】
: 那个nature biotechnology文章
: 我就是按照他的方法的library和cas9细胞
: 你说说看法吧
:
: Feng
: 高.
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V******t
发帖数: 444 | 10 http://www.nature.com/nbt/journal/v32/n3/full/nbt.2800.html
这个。
为何分开质粒会滴度低？
我想在mESC里面筛选，这篇文正好用mESC，所以选它了。
你说的信噪比，是说什么情况？
请再展开说点什么吧。
【在 d****u 的大作中提到】
: 有几篇呢，我不是很确定你具体指的哪一篇。我是按照Zhang lab那片science paper来
: 的。但是具体的protocol做了一些改变。那个时候他们的vector还是version 1. 病毒
: 的滴度在我们的细胞里还行，但是加多了会非特异性的杀细胞，所以感染的时候一定要
: 把MOI控制在比较低的水平。后来他们的version 2出来了，号称滴度增加10倍，但是在
: 我们的细胞里没看出有这么大的改善，但是在高MOI的时候对细胞的伤害不是那么大了
: 。从总体screen的质量来看，他们的library表现还是相当好的。
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d****u
发帖数: 1553 | 11 这个为什么载体分开滴度会低我们也不清楚。我们只是把几个主要实验室的载体要过来
在我们的系统里测试得到这样的结果。就像我上面说的，因为我们是用原代细胞，所以
可能没什么代表性。我们能下的结论就是Zhang lab的文库可以提供令人满意的滴度。
而随后的测序也证明的他们的文库里不同gRNA的distribution（也就是说平均每个gRNA
在文库里的丰度）也比较令人满意。你说的这个实验室的文库我们没有试过，我的建议
是最好对比两到三个不同的系统，然后决定用哪一个。
关于信噪比，在这里主要是指假阳性和真阳性的比例。因为在目前绝大多数的基因组级
别的筛选中，假阳性是一个没法回避的结果。虽然有很多方法可以减弱假阳性出现的概
率，但是基本没有可能完全消灭。那么在实验最开始的阶段，文库本身质量的优劣就从
一定程度上决定了你最后筛选结果的信噪比。举个例子说，如果你有两个文库中，第一
个文库中每一个gRNA都是均匀分布的，如果有80000个gRNA，每一个都有10000个copy在
你的文库里（现实中不可能实现），而第二个文库也有80000个gRNA，但是有10%到20%
的gRNA只有少于100个copy，而同样比例的gRNA有超过10000个copy。那么前一个文库的
质量要远好于第二个，筛选产生的信噪比就要高，剔除假阳性的几率也要大很多。这是
从文库的角度分析。
那么在筛选结束后的数据分析也可以帮助降低噪音，但是不管采用什么方法，都是以实
验结果为依据的，那么如果实验结果本身很混乱，数据分析不见得能帮上多大的忙。
另一个提高提高信号的方法，是在相同类型不同来源的细胞株同时进行筛选，然后对数
据进行对比。有点像现在常见的拿好几百个病人样本进行测序然后分析突变一样。这样
能够帮助排除很大一部分假阳性。但是同样也需要高质量的文库和严格控制的筛选流程
一点个人看法，希望对你有所帮助。
【在 V******t 的大作中提到】
: http://www.nature.com/nbt/journal/v32/n3/full/nbt.2800.html
: 这个。
: 为何分开质粒会滴度低？
: 我想在mESC里面筛选，这篇文正好用mESC，所以选它了。
: 你说的信噪比，是说什么情况？
: 请再展开说点什么吧。
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V******t
发帖数: 444 | 12 多谢你的信息！非常有用！
gRNA
【在 d****u 的大作中提到】
: 这个为什么载体分开滴度会低我们也不清楚。我们只是把几个主要实验室的载体要过来
: 在我们的系统里测试得到这样的结果。就像我上面说的，因为我们是用原代细胞，所以
: 可能没什么代表性。我们能下的结论就是Zhang lab的文库可以提供令人满意的滴度。
: 而随后的测序也证明的他们的文库里不同gRNA的distribution（也就是说平均每个gRNA
: 在文库里的丰度）也比较令人满意。你说的这个实验室的文库我们没有试过，我的建议
: 是最好对比两到三个不同的系统，然后决定用哪一个。
: 关于信噪比，在这里主要是指假阳性和真阳性的比例。因为在目前绝大多数的基因组级
: 别的筛选中，假阳性是一个没法回避的结果。虽然有很多方法可以减弱假阳性出现的概
: 率，但是基本没有可能完全消灭。那么在实验最开始的阶段，文库本身质量的优劣就从
: 一定程度上决定了你最后筛选结果的信噪比。举个例子说，如果你有两个文库中，第一
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s*****i
发帖数: 315 | 13 请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢？
Cas9本身比较大，包装病毒的滴度会比较低
Feng
高.
【在 d****u 的大作中提到】
: 哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧，都在大牛杂志上呢。
: 至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上，根据我们的经验，目前最好用的是Zhang Feng
: lab的version 2 all in one vector。
: 有几个实验室载体分开的，必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
: 的不同而异，我们用的是原代细胞，不见得有普遍性。
: 不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
: 从screen的角度来讲，crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高.
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d****u
发帖数: 1553 | 14 我们目前的经验是all in one vector和separate vector的滴度差别并没有那么显著(
这个经验是4个月前的，现在有可能有更好的）。而且因为我们用的是primary cell，
本身就不像cell line那样可以传很多很多代。我们用的那个single cas9 vector滴度
又特别低（现在可能有更好的）。光把细胞养起来就好几个passage过去了。 在这种情
况下，all in one vector对我们来说更合适。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢？
: Cas9本身比较大，包装病毒的滴度会比较低
:
: Feng
: 高.
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s*******1
发帖数: 188 | 15 能告诉我你用的那个separate vector的质粒名称吗? the one for sgRNA and the
other one for cas9.
谢谢
【在 d****u 的大作中提到】
: 我们目前的经验是all in one vector和separate vector的滴度差别并没有那么显著(
: 这个经验是4个月前的，现在有可能有更好的）。而且因为我们用的是primary cell，
: 本身就不像cell line那样可以传很多很多代。我们用的那个single cas9 vector滴度
: 又特别低（现在可能有更好的）。光把细胞养起来就好几个passage过去了。 在这种情
: 况下，all in one vector对我们来说更合适。
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d****u
发帖数: 1553 | 16 我们试的是Sabatini & Landers group的inducible system。质粒的名字实在记不住了
，因为我们要质粒的时候还挺早的，那时候这些实验室自己的编号和后来他们放在
addgene上的编号不太一样。你去addgene上找landers lab的质粒就很容易能找到。不
过我们用下来觉得第一，他们cas9的质粒做成病毒后滴度太低，第二，这个质粒泄漏的
比较厉害，虽然号称是可诱导的，但是用flag染色还是能看见不少阳性的细胞。
【在 s*******1 的大作中提到】
: 能告诉我你用的那个separate vector的质粒名称吗? the one for sgRNA and the
: other one for cas9.
: 谢谢
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V******t
发帖数: 444 | 17 没错，我就是建立一个cas9 inducible 的stable cell line
然后sgRNA library
【在 s*****i 的大作中提到】
: 请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢？
: Cas9本身比较大，包装病毒的滴度会比较低
:
: Feng
: 高.
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s*******1
发帖数: 188 | 18 在感染细胞时，dual vector system需要两个病毒插入基因组，这样一来，其造成的损
伤是不是要比single vector大 |
d****u
发帖数: 1553 | 19 这个接下来细胞就要接受严峻的双链断裂的考验了，前边这点应该不算啥。呵呵，开玩
笑的！这个实在是因细胞不同而不同。有些细胞就是皮实，怎么转也没关系。有些细胞
就是不行，一点点病毒加进去就挂了。
【在 s*******1 的大作中提到】
: 在感染细胞时，dual vector system需要两个病毒插入基因组，这样一来，其造成的损
: 伤是不是要比single vector大
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l*******e
发帖数: 170 | 20 感谢热心回复的同学！
我这些天忙没有及时回帖。
我在多做些研究，多讨论讨论，从有经验的人那里拿到的信息比pubmed有用多了，我的
经验。 |
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V******t
发帖数: 444 | 21 我刚收到addgene上买来的feng zhang的library
以后基于细胞的screen就是个常规实验了。很多基因很快就要被一网打尽了
要是这些screen都能自动化就好了 可惜没人愿意把生物实验室自动化、标准化啊
【在 l*******e 的大作中提到】
: 感谢热心回复的同学！
: 我这些天忙没有及时回帖。
: 我在多做些研究，多讨论讨论，从有经验的人那里拿到的信息比pubmed有用多了，我的
: 经验。
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r***z
发帖数: 19 | |
z****u
发帖数: 1007 | 23 真的假的？咋个搜到一个啥 梦的初始点 群
【在 r***z 的大作中提到】
: CRISPR QQ 群 308680140
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r***z
发帖数: 19 | |
g*******g
发帖数: 45 | |
l**********x
发帖数: 28 | 26 zan
【在 z****u 的大作中提到】
: 真的假的？咋个搜到一个啥 梦的初始点 群
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